免疫磁珠分離法分選提純骨髓造血干細(xì)胞cd117

《免疫磁珠分離法分選提純骨髓造血干細(xì)胞cd117》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。

1、免疫磁珠分離法分選提純骨髓造血干細(xì)胞CD117【摘要】目的：探討用免疫磁珠分離法（magneticactivatedcellsorting,MACS）從小鼠股骨、脛骨分離純化骨髓造血干細(xì)胞CD117的方法。方法：收集小鼠骨髓細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色觀察其活力，用免疫磁珠分離法分選CD117細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光標(biāo)記CD117表達(dá)陽(yáng)性率。結(jié)果；未分選前CD117細(xì)胞純度為(41.56±18.77)%，MACS分選CD117細(xì)胞純度(88.68±4.74)%，純化前后有明顯差異（P<0.05）。結(jié)論：MACS陽(yáng)性選擇法分選系統(tǒng)能有效分選骨髓造血干細(xì)胞CD117?！娟P(guān)鍵詞】造血干細(xì)胞CD117

2、+細(xì)胞免疫磁珠分離法小鼠近交BALBC造血干細(xì)胞（HSCs）研究面臨的首要問題是獲得大量純化的造血干細(xì)胞,并去除雜質(zhì)細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾[1，2]，近年在純化技術(shù)方面的研究不多，尤其是對(duì)小鼠的研究較少。CKit或干細(xì)胞因子受體SCFR（CD117）是小鼠HSCs的主要標(biāo)志[3]，2006年采用免疫磁珠分離法(MACS)分選骨髓造血干細(xì)胞亞群CD117，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，希望為造血干細(xì)胞的純化和大量制備提供實(shí)驗(yàn)方法和理論支持。1材料和方法91.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/C小鼠,(20±1)g,雌雄隨機(jī),10只/組，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。1.2試劑和儀器BSA購(gòu)自杭州四季青生

3、物工程材料研究所,熒光標(biāo)記小鼠抗體CD117PE磁珠試劑盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分離器及MS分離柱，均購(gòu)自MiltenyiBiotec公司,流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)購(gòu)自BD公司。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1小鼠骨髓細(xì)胞收集頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠股骨、脛骨，放在盛有緩沖液（含2mmol/LEDTA，0.5%BSA的PBS）的平皿中，去除骨上的肌肉組織及骨膜，切除骨的兩末端，用1ml注射器（帶4號(hào)針頭）插入股骨膝蓋端、脛骨骨端，用緩沖液反復(fù)沖洗骨腔，直至骨發(fā)白，所得細(xì)胞過200目濾網(wǎng)，1500r/min離心10min，小心去除上清液，加入59ml緩沖液混勻，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)

4、。1.3.2MACs分離CD117細(xì)胞1.3.2.1小鼠系別細(xì)胞去除用緩沖液按40μl/107個(gè)細(xì)胞重懸小鼠骨髓細(xì)胞。加入生物素化抗體混合物10μl/107個(gè)細(xì)胞，混勻，4～8℃孵育10min。加入緩沖液30μl/107個(gè)細(xì)胞，20μl抗生物素微珠，混勻，4～8℃孵育15min。加入5ml緩沖液洗滌細(xì)胞，1500r/min離心10min，完全去除上清液。1.3.2.2磁性標(biāo)記和分選CD117細(xì)胞將分選后得到的細(xì)胞用緩沖液按80μl/107個(gè)細(xì)胞重懸。加入CD117微珠20μl/107個(gè)細(xì)胞，混勻，4～8℃孵育15min，緩沖液1ml/107個(gè)細(xì)胞洗滌細(xì)胞，1500r/min離心10min

5、，完全去除上清，用500μl緩沖液重懸，所得細(xì)胞懸液加入MS分選柱中，收集先行流出的未標(biāo)記細(xì)胞組分，并用1500μl緩沖液沖洗MS柱，此為CD117陰性細(xì)胞。將分選柱移出磁場(chǎng)，1ml緩沖液快速將分選柱上滯留的細(xì)胞洗脫下來，這些細(xì)胞是磁性標(biāo)記的CD117陽(yáng)性細(xì)胞。1.3.3流式細(xì)胞儀分析9將分選前的標(biāo)本、對(duì)照管、分選后陰性管標(biāo)本及分選后陽(yáng)性管標(biāo)本進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。在上述富集細(xì)胞管中加入100μl緩沖液，10μlCD117抗體混勻，4℃黑暗中孵育10min，加入1000μl緩沖液1500r/min離心10min，完全去除上清液，加入500μl緩沖液混勻，送流式細(xì)胞分析,設(shè)陰性對(duì)照和空白對(duì)照

6、。1.3.4細(xì)胞染色計(jì)數(shù)0.4%臺(tái)盼藍(lán)按9∶1（V∶V，細(xì)胞懸液量：染色液量）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。鏡下觀察，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染。細(xì)胞活力的測(cè)定:0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色1min，計(jì)算活細(xì)胞率，活細(xì)胞率（%）=活細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)）×100%。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS11.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，用配對(duì)樣品t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1骨髓細(xì)胞的收集從1只小鼠股骨、脛骨可收集5.25×107個(gè)骨髓細(xì)胞，細(xì)胞活力90%，2只小鼠股骨、脛骨可收集8.48×107個(gè)骨髓細(xì)胞，細(xì)胞活力92%。92.2MACS分選造血干細(xì)胞1只小鼠股骨、脛骨可收集（

7、1.1±0.3）×105個(gè)造血干細(xì)胞。2.3流式細(xì)胞儀分析結(jié)果免疫磁珠純化前CD117陽(yáng)性細(xì)胞純度為（41.56±18.77)%，純化后CD117陽(yáng)性細(xì)胞純度為(88.68±4.74)%，純化前后有明顯差異（P<0.05）。經(jīng)免疫磁珠純化后、未經(jīng)免疫磁珠純化小鼠骨髓干細(xì)胞收集物，流式細(xì)胞儀測(cè)定CD117+陽(yáng)性細(xì)胞的純度見圖1?！　?討論骨髓內(nèi)主要有兩類干細(xì)胞群體,即造血干細(xì)胞(hematopoieticstemcells,HS