ssh抑制性消減雜交文庫構(gòu)建介紹

《ssh抑制性消減雜交文庫構(gòu)建介紹》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、SSH抑制性消減雜交文庫構(gòu)建方法介紹SSH是一項可以快速獲取兩個不同生物材料中差異表達(dá)基因的分子生物學(xué)技術(shù)，是快速篩選差異表達(dá)基因的有效方法，也是尋找新基因的重要手段。該技術(shù)尤其適合以genome尚不完全清晰的物種或者以特殊材料為研究對象的科研工作者。是基因芯片技術(shù)的有效補(bǔ)充。對于基因的研究,除了基因組計劃中從全基因組測序水平進(jìn)行結(jié)構(gòu)與染色體位置研究外,從表達(dá)序列水平進(jìn)行研究,是研究結(jié)構(gòu)基因的快捷方式。因為基因組中編碼的表達(dá)基因只占全基因組的3%～5%,而某一時期的基因表達(dá)一般又只占全部基因的15%。構(gòu)建cDNA文庫,是從表達(dá)水平研究基因的基本內(nèi)容。由于基因表達(dá)頻率的不同,高拷

2、貝的mRNA每種有數(shù)千個,而與分化及特定代謝相關(guān)的基因則只有幾個拷貝,所以用普通cDNA文庫(ConventionalcDNAlibrary)進(jìn)行基因差異表達(dá)或用探針篩選目的基因的研究,是一勞動強(qiáng)度大、效率低而不經(jīng)濟(jì)的方法。雖然近年來出現(xiàn)了均等化cDNA文庫(NormalizedcDNAlibrary)來解決文庫中基因高豐度的問題,但某一時期生物體在組織細(xì)胞中表達(dá)的基因成千上萬種,確定哪個與要研究的問題直接相關(guān),這給判定及發(fā)掘特定功能中的相關(guān)基因帶來困難。差減文庫的出現(xiàn)則避免了上述兩種cDNA文庫在基因差異表達(dá)研究上存在的問題,該技術(shù)自80年代初產(chǎn)生以來有了許多改進(jìn)與發(fā)展。基本

3、流程:通過差減文庫構(gòu)建，文庫驗證和篩選（逆向斑點雜交），獲得陽性克隆，對陽性克隆測序及生物信息分析，可判定差異基因的情況。另外結(jié)合RACE技術(shù)可進(jìn)一步克隆所獲得的差異基因的cDNA全長序列，并可用Northernblot或Real－TimePCR加以驗證。SSH優(yōu)勢：抑制性消減雜交文庫技術(shù)是一種革命性的差異表達(dá)基因篩選技術(shù)。該方法結(jié)合了抑制性PCR和消減雜交技術(shù)，即御用PCR反應(yīng)鏈內(nèi)退火有限于鏈間退火的特點和分子雜交二級動力學(xué)原理，經(jīng)過體系不斷優(yōu)化建立起來的快捷、有效的差異基因篩選方法。與傳統(tǒng)的DD—PCR、SAGE及cDNA—RNA等技術(shù)相比，具有低豐度mRNA富集效率高、假

4、陽性低、靈敏度高重復(fù)性好等特點?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于動植物發(fā)育和分化、疾病易感性差異、抗藥性差異和組織（病理和正常樣本）差異及微生物基因分型差異的研究。技術(shù)方法成熟有效,不需要利用傳統(tǒng)的物理方法對單鏈、雙鏈cDNA進(jìn)行分離。只要目的序列存在，就能進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，篩選出差異基因片段。放大稀有轉(zhuǎn)錄本,本技術(shù)在同一操作下完成轉(zhuǎn)錄本豐度平衡和差減，在我們的模型實驗中，稀有轉(zhuǎn)錄本至少被放大了5000倍，也就是說，利用本及時可以極大地增加獲得表達(dá)差異地稀有轉(zhuǎn)錄本地可能性。僅僅需要500ng的polyA＋RNA與其他的消減雜交方法不同，應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)只需要0.5－2的polyA+RNA即可進(jìn)

5、行有效實驗。如果您只有極少量（50ng-100ng）的總RNA，我們可以通過polyA＋RNA的高保真線性放大技術(shù)來合成足量的cDNA來進(jìn)行抑制性消減雜交實驗。尋找差異表達(dá)的基因有不少方法，抑制消減雜交（SSH）是比較有效的一種方法。以Clontech的PCR-SelectcDNASubtractionKit為例：將樣品（tester）和對照（driver）的mRNA分別反轉(zhuǎn)錄并合成為雙鏈cDNA后進(jìn)行酶消化；樣品（tester）分為兩組，分別加上不同的adaptor1/2；再將兩組樣品（tester）分別與過量的對照（driver）雜交，兩份雜交結(jié)果混合，加入過量的對照再進(jìn)行

6、第二輪雜交；補(bǔ)齊adaptor然后用PCR選擇性擴(kuò)增。由于過量的對照封閉了在樣品中共同表達(dá)的基因，而在樣品中特異表達(dá)的基因會被選擇性地擴(kuò)增出來，這些擴(kuò)增的片斷經(jīng)過克隆、測序后可以進(jìn)行拼接或者用RACE的方法從已知片斷釣全長cDNA，再做進(jìn)一步的分析。差減雜交是構(gòu)建差減文庫的核心,差減文庫是否構(gòu)建成功很大程度上決定于差減雜交的效率。