脊髓損傷基因治療的研究進展

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1、脊髓損傷基因治療的研究進展關(guān)鍵詞：脊髓損傷基因治療1990年美國首次成功地進行腺苷脫胺酸缺乏的基因治療以來，基因治療已成為當前生物醫(yī)學中進展最快的領(lǐng)域之一［1］。基因治療在脊髓損傷后軸突再生中亦可望成為有效的手段之一［2—5］。利用外源基因在靶細胞中的表達，以改變神經(jīng)元某些內(nèi)在特性，從而進一步探索sCI后神經(jīng)元的存活能力，再生特性和功能恢復的分子機理，最終為sCI的治療探討新途徑是目前治療sCI的研究方向。它有助于把sCI治療提到一個新的水平。值得我們進一步研究。一、sCI基因治療有關(guān)分子生物學基礎(chǔ)基因轉(zhuǎn)移是實現(xiàn)基因治療的關(guān)鍵技術(shù)［6］。因此，基因治療的首要步驟是轉(zhuǎn)導基因的

2、分子構(gòu)建。一般轉(zhuǎn)導基因由目的基因cDNA，啟動子／增強子和載體三部分組成。目的基因重組時除本身特有的序列外，通常還需進行必要的修飾，如轉(zhuǎn)錄起始修飾，翻譯起始，內(nèi)含子和聚腺苷酸化信號等的修飾。用于重組的啟動子／增強子，一般有三種：強組成型，管家型，及組織持異型啟動子，其中最常用為第一型［7］。理想的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移載體要求：轉(zhuǎn)移具有細胞靶向性，導入基因的表達可調(diào)控，而且轉(zhuǎn)移的方法簡便易行。用于sCI的基因轉(zhuǎn)移載體主要是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，即乳腺病毒、莫羅尼小鼠白血病病毒和勞斯肉瘤病毒等。構(gòu)建轉(zhuǎn)錄病毒載體的基本原理是：病毒的長末端重復序列可以對插入的外源基因進行有效轉(zhuǎn)錄，這樣先在體外構(gòu)

3、建反轉(zhuǎn)錄病毒前病毒dNA載體，即酶切去除基因組中的反式作用區(qū)域，產(chǎn)生缺陷型的反轉(zhuǎn)錄病毒，這種病毒只具有控制感染和整合的序列。缺陷型病毒載體必須依賴包裝細胞提供的蛋白質(zhì)才能完成包裝，產(chǎn)生帶有外源基因的偽病毒。它能感染受體細胞，載體dNA將依靠其lTR整合入受體細胞染色體基因組，這樣外源基因被帶入宿主細胞并得以表達［2、3、6、7］。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染率高，最常用于體外間接基因治療，其缺點是要求靶細胞必須有增殖和分裂特性［8］。此外，cao［9］等研究用陽離子脂質(zhì)體直接注入cNS作基因轉(zhuǎn)移獲得成功。但因陽離子脂質(zhì)體對cNS有毒性，故目前致力于發(fā)展非病毒技術(shù)，一種陽離子多聚體一聚

4、乙烯亞胺業(yè)已用于基因轉(zhuǎn)移［10］。另有selle［6］等報道的復制缺陷腺病毒也是一種適用于神經(jīng)系統(tǒng)的理想載體。在sCI治療中，由于受體細胞要植入脊髓內(nèi)，因此所用受體細胞應(yīng)當符合一定的標準［4、6］：①容易獲取和繁殖；②移植后能長期存活且能繼續(xù)分裂和具有活力。③無免疫源性及形成腫瘤的危險。目前已用于sCI試驗有雪旺氏細胞和成纖維細胞［2、3、11］。此外，肌母細胞也是具有應(yīng)用前景的較好受體細胞，研究表明肌母細胞轉(zhuǎn)移至cNS至少可活6個月，且無腫瘤源性［12］?；蛑委煹膶嵤?，有賴于將目的基因準確、高效地轉(zhuǎn)入靶細胞，并使之安全，高效和可控地表達?；蛑委熤谢蜣D(zhuǎn)移的策略主要有兩

5、種，即活體外法和在體法。活體外法就是在體外先對適當細胞進行遺傳修飾，使其表達和分泌特定的重組蛋白，然后將修飾細胞移植入活體神經(jīng)組織，通過神經(jīng)遞質(zhì)替代或神經(jīng)營養(yǎng)因子和／其它治療因子的引入恢復正常的神經(jīng)功能。這種方法尤其適于因缺乏nTF或神經(jīng)遞質(zhì)前體分子等可擴散物質(zhì)所致的cNS疾病。如帕金森氏病及cNS損傷。在體法是利用適當?shù)闹亟M病毒或化學基因轉(zhuǎn)移載體將目的基因及有治療作用的重組蛋白直接轉(zhuǎn)移，效率較低，故較少采用。此外，活體外法可采用自體的工程細胞移植，在體外可對高表達細胞克隆進行篩選，有效的控制移植細胞的數(shù)量和質(zhì)量，應(yīng)用立體定位和成像技術(shù)可以將工程細胞十分準確地移植到cNS特

6、定的區(qū)域內(nèi)，以保證在局部產(chǎn)生高濃度的治療因子。二、基因治療sCI的現(xiàn)狀和展望基因治療sCI尚處于實驗探索階段。目前，主要是采用nTF基因修飾雪旺氏細胞或成纖維細胞后再將其植入鼠的脊髓損傷區(qū)，觀察其軸突再生的情況［2、3、11］。tuszyski［11］將nGF基因?qū)肱囵B(yǎng)的sC內(nèi)，再將sC移植到損傷的脊髓，發(fā)現(xiàn)sC在體內(nèi)能穩(wěn)定地表達nGF并促進軸突的再生。同年tuszynski等［2］利用來源于莫洛氏鼠白血病的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將人的nGF基因?qū)胧蟪衫w維細胞中，再將成纖維細胞移植到半橫貫損傷的鼠脊髓中。1年后成纖維細胞仍能表達nGF，電鏡及免疫組化檢查，發(fā)現(xiàn)有大量的脊髓軸突

7、再生。1996年，tuszynski等［3］采用同樣方法，又將nGF基因?qū)氤衫w維細胞中，并將其移植到半橫斷損傷的鼠脊髓中，14月后，通過rT—pCR技術(shù)鑒定成纖維細胞仍表達nGF。電鏡、免疫組化檢查發(fā)現(xiàn)有大量的軸突再生。作者在國際上首次構(gòu)造po—5＇—flanking介導的髓鞘堿性蛋白微基因的基礎(chǔ)上，通過陽離子脂質(zhì)體導入sC中，然后再將基因修飾的sC移植入成鼠半橫斷損傷脊髓，觀察其對sCI的再生修復作用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)pSVPoMcat微基因修飾sC對sCI后細胞凋亡有抑制作用［13］。當然利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)治療sCI，