流式細(xì)胞儀、免疫磁珠及親和板結(jié)合分離法分選ck

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1、流式細(xì)胞儀、免疫磁珠及親和板結(jié)合分離法分選ck【摘要】目的比較流式細(xì)胞儀、免疫磁珠及親和板結(jié)合分離法分選肝癌亞群細(xì)胞的效果。方法原代培養(yǎng)肝細(xì)胞癌細(xì)胞，分別以流式細(xì)胞儀、免疫磁珠及親和板結(jié)合分離法分選ckit+肝癌細(xì)胞，然后使用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞純度，計(jì)算回收率；以臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，裸鼠移植測(cè)其成瘤率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果流式細(xì)胞儀分選所得到的ckit+肝癌細(xì)胞純度、回收率最高，與其他兩種方法分選所得細(xì)胞的相應(yīng)指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3種方法所得細(xì)胞之

2、間的細(xì)胞活力、刺激指數(shù)、移植成瘤率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。流式細(xì)胞儀分選前后的細(xì)胞之間活力、刺激指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論流式細(xì)胞儀分離法是分離肝癌亞群細(xì)胞的較佳方法?！娟P(guān)鍵詞】流式細(xì)胞儀；免疫磁珠；親和板結(jié)合分離法【Abstract】ObjectiveToparetheeffectofthreemethodsincludingfloetrysorting,magiccellsortingandimmunepanningisolationinisolatingsub

3、-populationinhepatomacarcinomacells.Methodsckitpositivecellsinprimarilyculturedhumanhepatomacarcinomacellsetrysorting,magiccellsortingandimmunepanningisolation,respectively.Thepurity,viabililty,cellproliferationandtheratiooftumorigenesisaftertransplantationo

4、fthehepatomacarcinomacellsinedetry,trypanblueexclusion,CCK8assayandallogeneicgrafttonudemouserespectively.Then,thedataetrysortingethods,ulationindexandtumorigenesisaftertransplantationamongthecellsisolatedethods(P>0.05).Thereetrysorting(P>0.05).Conclusi

5、onsFloetrysortingisaneffectiveandpracticalmethodforisolatingsubpopulationinhepatomacarcinomacells.【Keyetry;Magiccellsorting;Immunepanningisolation腫瘤干細(xì)胞研究需要獲取高純度、高活力、高增殖能力的腫瘤亞群細(xì)胞，并盡量避免混雜細(xì)胞、低活力、低增殖能力細(xì)胞對(duì)細(xì)胞亞群特性的干擾。筆者在前期研究的基礎(chǔ)上［1］，比較了流式細(xì)胞儀分選(floetrysorting，F(xiàn)CMS)、免疫

6、磁珠分選(magiccellsorting，MACS)及親和板結(jié)合分離法(immunepanningisolation)3種方法分選ckit+肝癌細(xì)胞的效果，以期找到一種分離肝癌亞群細(xì)胞的較佳方法，為腫瘤干細(xì)胞的研究奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料1.1.1標(biāo)本：取材于南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院2006年4月經(jīng)手術(shù)切除的肝癌標(biāo)本，經(jīng)病理證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞癌。患者術(shù)前未進(jìn)行任何抗腫瘤治療，手術(shù)后患者4周內(nèi)存活。1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：裸小鼠(BALB/c)75只，雌雄兼用，3～5周齡，質(zhì)量10～20g，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物

7、實(shí)驗(yàn)中心提供。1.1.3主要試劑：低糖、胰蛋白酶、無(wú)鈣鎂離子的平衡鹽溶液(DHank'S液，pH7.2～7.4)、細(xì)胞增殖試劑CCK8購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青公司；兔抗人ckit多克隆抗體、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶200)購(gòu)自丹麥SantaCruz公司；抗兔IgG1免疫磁珠購(gòu)自德國(guó)MiltenyiBiotech公司；其他常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。1.1.4主要儀器：免疫磁珠分選磁力架、MS磁性分離柱購(gòu)自德國(guó)MiltenyiBiotec公司；EpicsAltra型流式細(xì)胞儀購(gòu)

8、自美國(guó)BeckmanCoulter公司；各種常用耗材購(gòu)自廣州威佳科技公司。1.2方法1.2.1分離、培養(yǎng)肝癌細(xì)胞：結(jié)合分離法，以兔抗人ckit多克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，分選ckit-細(xì)胞和ckit+細(xì)胞。每種方法分選出5組細(xì)胞，進(jìn)行如下檢測(cè)。(1)細(xì)胞活力檢測(cè)：采用臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力并計(jì)算細(xì)胞存活率=［活細(xì)胞總數(shù)/(活