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1、SN中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1375-2004玉米細(xì)菌性枯萎病菌檢疫鑒定方法MethodsforquarantineandidentificationofPantoeastewartii(Smith)Mergaertetal.2004-06-01發(fā)布2004-12-01實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局SN/T1375-2004引言玉米細(xì)菌性枯萎病(Stewart'sBacterialWiltofCorn)是玉米上的一種毀滅性的病害，我國(guó)尚無(wú)該病害發(fā)生。該病可以通過(guò)帶菌種子遠(yuǎn)
2、距離傳播(種傳)，在病區(qū)則以昆蟲(chóng)傳播為主。其病原菌Pawoeastewartii(Smith)Mergaertetal.，異名:Erwiniastewartii(Smith)Dye，中文名稱:斯氏泛菌。在1992年農(nóng)業(yè)部頒布的《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫危險(xiǎn)性病、蟲(chóng)、雜草名錄》中，被列為一類危險(xiǎn)性有害生物。為保護(hù)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，防止玉米細(xì)菌性枯萎病傳人我國(guó)，做好進(jìn)境植物檢疫工作，規(guī)范并正確掌握該病菌的檢疫鑒定方法，特制定本標(biāo)準(zhǔn)。SN/T1375-2004玉米細(xì)菌性枯萎病菌檢疫鑒定方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了進(jìn)境植
3、物檢疫中玉米細(xì)菌性枯萎病菌的檢疫和鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于進(jìn)境種用及其他用途玉米中玉米細(xì)菌性枯萎病菌的檢疫和鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T4789.28-1994食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑原理3.1玉米細(xì)菌性枯姜病菌的分類地位玉米細(xì)菌性枯萎病菌
4、Pantoeastewartii(Smith)Mergaertetal.，異名:Erwiniastewartii(Smith)Dye屬原核生物總界Procaryotae細(xì)菌界Bacterium,薄壁菌門Gracilicutes,腸桿菌科Enterobacteri-aceae，泛菌屬Pawoea。為兼性厭氧桿菌，革蘭氏陰性，大小為0.4km--0.7pm乘0.9pm-2.0gym,無(wú)鞭毛，兩端鈍圓，單生或以短鏈形式存在。該病菌在玉米上引發(fā)的玉米細(xì)菌性枯萎病是一種典型的維管束病害，此病害為種傳，帶菌種子是其
5、遠(yuǎn)距離傳播的主要因素。32檢疫原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)及免疫吸附分離試驗(yàn)利用血清學(xué)技術(shù)具有特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，與常規(guī)生理生化鑒定技術(shù)協(xié)同應(yīng)用于玉米種子中P.stewartii的檢測(cè)、分離和鑒定，具有快速、靈敏、有效且結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適合對(duì)玉米種子中尸.stewartii的檢疫鑒定。儀器、設(shè)備小型粉碎機(jī)、超凈工作臺(tái)、天平、恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、生物顯微鏡、酶標(biāo)儀、洗板器、酸度計(jì)、高速冷凍離心機(jī)、可調(diào)移液器、聚苯乙烯塑料培養(yǎng)皿等5藥品、試劑、培養(yǎng)墓檢驗(yàn)中所需的藥品均為分析純。5.1藥品碳酸鈉(Na,
6、CO,),碳酸氫鈉(NaHCO,),磷酸氫二鈉(Na,HP認(rèn)。I2H_O),磷酸二氫鉀(KH,PO,),氯化鈉(NaCl),氯化鉀(KCl,氯化鈣(CaCli),吐溫-20(Tween-20),磷酸氫二鉀(K,HP認(rèn))、硫酸鎂(MgS認(rèn)"7H,0)、雙氧水(H,O,)、四甲基聯(lián)苯胺、二甲基亞礬、蛋白陳、蔗搪(C=Hx認(rèn);)、抗壞血酸(CsHg認(rèn)),A蛋白(SPA),酶標(biāo)記A蛋白(HRP-SPA)、升汞(HgCl)或次氯酸鈉(NaOCI),95%乙醇(CH,CH,OH)等。5,2試劑革蘭氏染色液、鞭毛染色
7、液。53培養(yǎng)基改良W氏培養(yǎng)基。制作方法見(jiàn)附錄A。SN/T1375-20046對(duì)照菌株和抗血清陰、陽(yáng)性對(duì)照菌。其中陰性對(duì)照菌可選用除P.stewart“以外的、不同種的細(xì)菌菌株，一般為同屬不同種的菌;革蘭氏染色中的陰性對(duì)照菌為大腸桿菌(Escherichiaroli)。對(duì)照菌在應(yīng)用中需配制成10'cfu/mL濃度的菌懸液。檢驗(yàn)中所需抗體均為同種P.stewartii抗血清，其使用濃度依其效價(jià)而定。7玉米細(xì)菌性枯萎病菌P.stewart“的檢測(cè)、分離及鑒定7.1檢驗(yàn)樣品的制備從待檢樣品中挑選不成熟的、皺縮的
8、、有穗軸的及色澤較深的籽粒作為檢驗(yàn)樣品。每份檢驗(yàn)樣品應(yīng)不少于。.25kg。待檢樣品在。.25kg以上、1kg以下的，檢驗(yàn)樣品可適當(dāng)減少，但不得低于。.125kg.7.2樣品的檢驗(yàn)檢測(cè)懸液的制備:.:樣品表面消毒將檢驗(yàn)樣品用。.1%升汞(HgCU溶液進(jìn)行表面消毒處理1min-2min，或用3寫(xiě)^-5%的次抓酸鈉(NaOCI)表面消毒處理5min--15min，然后無(wú)菌水沖洗三次，無(wú)菌條件下晾干。對(duì)于藥劑拌種的種子樣品，可用95%乙醇(CH,C
