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《serex法篩選免疫相關(guān)性全血細胞減少癥患者造血細胞靶抗原及其初步鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、分類號：R55學(xué)校代碼：10062密級：學(xué)號：2012601123博士學(xué)位論文DOCTORALDISSERTATION論文題目：SEREX法篩選免疫相關(guān)性全血細胞減少癥患者造血細胞靶抗原及其初步鑒定TITLEScreeningautoantigensonthehematopoieticcellofimmuno-relatedpancytopeniapatientsbySEREXandpreliminaryidentificationofthescreenedautoantigens一級學(xué)科：臨床醫(yī)學(xué)二級學(xué)科：內(nèi)科學(xué)血液病學(xué)論文作者：郝山鳳指導(dǎo)教師：邵宗鴻教授天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二O一五年五月
2、分類號：R55學(xué)校代碼：10062密級：學(xué)號：2012601123學(xué)位類別：科學(xué)學(xué)位?專業(yè)學(xué)位?學(xué)科門類：醫(yī)學(xué)博士學(xué)位論文DOCTORALDISSERTATION論文題目：SEREX法篩選免疫相關(guān)性全血細胞減少癥患者造血細胞靶抗原及其初步鑒定TITLEScreeningautoantigensonthehematopoieticcellofimmuno-relatedpancytopeniapatientsbySEREXandpreliminaryidentificationofthescreenedautoantigens一級學(xué)科：臨床醫(yī)學(xué)二級學(xué)科：內(nèi)科學(xué)血液病學(xué)論文作者：郝山鳳指導(dǎo)教師：
3、邵宗鴻教授導(dǎo)師組成員：付蓉教授王化泉主任醫(yī)師天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二O一五年五月學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨立進行研究工作取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容和致謝的地方外，論文中不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：日期：2015年05月20日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解天津醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，并采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編以供
4、查閱和借閱。同意學(xué)校向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文，并編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫。保密，在年解密后適用本授權(quán)書。本論文屬于不保密√。（請在相對應(yīng)的方框內(nèi)打“√”）學(xué)位論文作者簽名：日期：2015年5月20日導(dǎo)師簽名：日期：2015年5月20日中文摘要目的：篩選并鑒定出可能會作為免疫相關(guān)性全血細胞減少(immuno-relatedpancytopenia,IRP）患者骨髓造血細胞上的自身抗原。背景：IRP是一種免疫介導(dǎo)的血細胞減少癥。前期研究發(fā)現(xiàn)IRP發(fā)病機制首先是某種原因引起T淋巴細胞調(diào)控失衡，Th2細胞比例增多導(dǎo)致B淋巴細胞數(shù)量/亞群/功能異常，進而產(chǎn)生抗骨髓未成熟造血細胞自身抗體并破壞或抑制骨髓造血，
5、最后引起的血細胞減少癥候群。但是IRP自身抗體所攻擊的造血細胞上的靶抗原目前尚不明確，之前本中心利用SDS-PAGE聯(lián)合免疫印跡法發(fā)現(xiàn)了幾種靶抗原，包括G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）156變異體，P鏈人紅細胞帶3蛋白，乳鐵蛋白及WD重復(fù)序列蛋白。自身免疫性疾病的靶抗原往往數(shù)個甚至數(shù)十個，所以以上方法所驗證的抗原僅為極少數(shù)，因此本實驗采用重組cDNA表達文庫的血清學(xué)分析法（SEREX）繼續(xù)尋找IRP自身抗體的靶抗原，并且進一步驗證其抗原性。材料與方法：我們構(gòu)建了K562細胞的噬菌體展示文庫，用它替代人骨髓CD34+細胞的蛋白文庫。然后用IRP患者和正常健康對照血清對這個文庫進行血清免疫學(xué)分析。噬菌
6、體表達蛋白的初步挑選是建立在患者與正常健康對照組患者的血清抗體對靶蛋白親和力差別的基礎(chǔ)上,噬菌斑與IRP患者血清孵育，挑選出陽性噬菌斑進行洗脫、擴增、鋪板、篩選，若陽性噬菌斑與患者血清呈陽性反應(yīng)，而與正常血清孵育呈陰性反應(yīng)，則進行該陽性噬菌斑測序。噬菌體表達蛋白的基因序列確認(rèn)后，將該噬菌體攜帶的cDNA片段進行相對應(yīng)蛋白的表達純化。我們將FTL,TRMT112,TRAPPC三種基因分別進行基因克隆并且連接入表達載體pEASY-E1，連接成功的重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌Ecoli-BL21進行相應(yīng)蛋白的表達；并對表達的蛋白進行WB驗證以及鎳柱純化。最后我們用純化的蛋白包被ELISA板，用121例IRP
7、患者和15例MDS患者，14例SAA患者以及34名健康對照血清通過間接ELISA方法來檢測血清抗FTL抗體的水平以及抗EPOR抗體的水平，并且通過RT-PCR檢測了FTL以及EPOR的mRNA表達水平。最后我們對IRP患者的臨床指標(biāo)進行了分析。結(jié)果：1.成功構(gòu)建了cDNA表達文庫，文庫的庫容，代表性以及重組率均符合下一步繼續(xù)篩選的要求。-I-2．通過免疫印跡的方法初步挑選出了11個陽性噬菌斑，經(jīng)過提取質(zhì)粒測序
