生化酶學(xué)教材

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1、高低。根據(jù)酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線，采用合理的方法進(jìn)行的酶活性濃度測(cè)定，原理科學(xué)、方法簡(jiǎn)便、靈敏度高、成本低、應(yīng)用廣泛。(一)酶活性濃度的表示方法酶活性用活性單位表示，常用的酶活性單位有慣用單位、國(guó)際單位和Katal單位。1．慣用單位20世紀(jì)50年代以前常用首先報(bào)告某種酶測(cè)定方法的臨床酶學(xué)家的名字來(lái)命名該酶的活性單位，如測(cè)定AMY的Somogyi單位，轉(zhuǎn)氨酶的Karmen單位等。酶不同，慣用單位就不同，即使同一種酶也因測(cè)定方法不同而有數(shù)種活性單位，應(yīng)用不便，現(xiàn)已少用。2．國(guó)際單位1963年國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)

2、推薦采用國(guó)際單位來(lái)統(tǒng)一表示酶活性的大小，即在25℃及其他最適條件下，每分鐘催化1微摩爾底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物所需要的酶量為一個(gè)國(guó)際單位。1965年將溫度改為30℃，1972年又取消了對(duì)溫度的規(guī)定。到1976年對(duì)酶活性單位的定義為：在特定的條件下，1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)變1微摩爾底物的酶量為一個(gè)國(guó)際單位，以IU表示，即1IU=1μmol／min。由于未指定反應(yīng)溫度，目前省略國(guó)際二字，即常將IU簡(jiǎn)寫為U。3．Katal單位1979年國(guó)際生化協(xié)會(huì)為了使酶活性單位與國(guó)際單位制(SI)的反應(yīng)速率相一致，推薦用Katal單位(

3、也稱催量，簡(jiǎn)寫為Kat)。即在規(guī)定條件下，每秒鐘催化1摩爾底物轉(zhuǎn)化所需的酶量，1katal=1mol／s。我國(guó)法定計(jì)量單位制中的酶催化活性單位為katal，其對(duì)血清中酶量而言顯然過(guò)大，故常用單位為μkatal或nkatal。1katal=60×106U，1U=1μmol／min=16.67nmol／s=16.67nkatal。4．酶活性濃度單位臨床上測(cè)定的不是酶的絕對(duì)量而是濃度。酶活性濃度以單位體積所含的酶活性單位數(shù)表示。常用U／L來(lái)表示體液中酶催化濃度，也可用katal/L報(bào)告酶活性濃度。(二

4、)酶促反應(yīng)進(jìn)程酶促反應(yīng)體系中，底物濃度[S]和產(chǎn)物濃度[P]隨著反應(yīng)的進(jìn)行不斷發(fā)生變化。如將酶反應(yīng)過(guò)程中測(cè)得的[P]或[S]變化量對(duì)時(shí)間作圖，可得酶促反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線(圖4-1)。該曲線反映了酶促反應(yīng)進(jìn)程中主要成分的變化規(guī)律，也可以從中得到酶促反應(yīng)的速度。圖中[P]或[S]變化曲線的斜率就代表酶促反應(yīng)的速率。典型的酶促反應(yīng)過(guò)程一般包括三個(gè)時(shí)期，即延滯期、線性期和非線性期。1．延滯期延滯期(lagphase)是指反應(yīng)開始的一段時(shí)間，此時(shí)[S]開始下降，隨之有相應(yīng)[P]逐漸增加。但由于多種因素的影響

5、，該期酶促反應(yīng)速度比較慢。不同反應(yīng)的延滯期長(zhǎng)短不等，可以從幾秒到幾分鐘。單一酶促反應(yīng)的延滯期是從反應(yīng)開始至達(dá)到最大反應(yīng)速度所需要的時(shí)間。期間發(fā)生的變化包括酶活性中心的形成與催化位點(diǎn)的暴露、酶與輔酶因子的結(jié)合、底物的解離、底物與酶的結(jié)合等。酶偶聯(lián)反應(yīng)的延滯期較長(zhǎng)，除了以上過(guò)程之外，還包括中間產(chǎn)物的積聚、指示反應(yīng)速度增加、指示反應(yīng)速度與待測(cè)酶的酶促反應(yīng)速度達(dá)到平衡所需的時(shí)間。因此，輔助酶越多延滯期就越長(zhǎng)，通常為1～3分鐘。2．線性期線性期(linearphase)是指延滯期后酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)

6、速度并保持相對(duì)恒定的一段時(shí)期，此時(shí)有過(guò)量底物存在，時(shí)間進(jìn)程曲線呈直線或接近直線狀態(tài)。因線性期底物量足夠，酶促反應(yīng)速率不受底物濃度的影響，產(chǎn)物[P]和底物[S]變化與t成直線關(guān)系，因此測(cè)定此時(shí)的酶促反應(yīng)速率就能較好地反映酶活性的大小。不過(guò)線性期是一個(gè)相對(duì)的概念，試劑中底物用量不可能大到完全不限制酶活性發(fā)揮的程度，而且底物量隨著反應(yīng)進(jìn)行而不斷消耗。一般認(rèn)為，當(dāng)?shù)孜锵牧啃∮?％，不足以明顯改變反應(yīng)速度時(shí)，仍認(rèn)為酶促反應(yīng)以初速度即最大速度進(jìn)行。在選定條件下，標(biāo)本中酶濃度越高，其線性期就越短。在實(shí)際工作

7、中往往需要根據(jù)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線，來(lái)設(shè)定線性期和非線性期的界限。3．非線性期非線性期(non-inearphase)又稱底物耗盡期，是指線性期后反應(yīng)速率明顯下降、酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線偏離直線的一段時(shí)期。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，底物濃度不斷下降，產(chǎn)物濃度不斷上升，使反應(yīng)體系中逆反應(yīng)增加；反應(yīng)產(chǎn)物的抑制作用、酶的熱失活、酶的聚合或解離等也會(huì)增加，這些原因會(huì)使酶促反應(yīng)變慢。在這段時(shí)期酶促反應(yīng)速度受底物濃度的影響較大，產(chǎn)物[P]和底物[S]變化與時(shí)間t之間不成直線關(guān)系。可見，只有依據(jù)酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線中線性期的反應(yīng)速

8、率才能準(zhǔn)確計(jì)算出反應(yīng)體系中的酶活性濃度。因此，不論采用哪種酶活性濃度測(cè)定方法，都應(yīng)該盡量保證在線性期進(jìn)行檢測(cè)，如果在延滯期或非線性反應(yīng)期檢測(cè)勢(shì)必造成較大的誤差。二、酶活性測(cè)定方法按照檢測(cè)時(shí)段的不同，酶活性測(cè)定方法可分為定時(shí)法和連續(xù)監(jiān)測(cè)法兩大類。(一)定時(shí)法定時(shí)法(flxedtimeassay)指測(cè)定酶促反應(yīng)過(guò)程中某一段時(shí)間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量，計(jì)算出該時(shí)段內(nèi)的平均反應(yīng)速度，再換算成μmol／min，以此代表待測(cè)酶的活性濃度。該法一般是在反應(yīng)一開始即計(jì)時(shí)，到達(dá)設(shè)定時(shí)間時(shí)加入終止劑(強(qiáng)酸、強(qiáng)