最新酶學(xué)-04酶分子的化學(xué)修飾教學(xué)講義PPT.ppt

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1、酶學(xué)-04酶分子的化學(xué)修飾酶化學(xué)修飾的應(yīng)用領(lǐng)域在基礎(chǔ)酶學(xué)研究上探測(cè)酶活性必需氨基酸的性質(zhì)和數(shù)目酶蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定酶蛋白的結(jié)構(gòu)變化與運(yùn)動(dòng)酶蛋白部分區(qū)域的構(gòu)象狀態(tài)酶的作用機(jī)理與催化反應(yīng)歷程酶分子的拓?fù)鋵W(xué)以及寡聚酶的亞基結(jié)合狀態(tài)酶的固定化技術(shù)酶純度的分析與檢測(cè)在疾病治療上克服酶在體內(nèi)的不穩(wěn)定性消除或降低酶的抗原性有助于酶分子到達(dá)并集中于病灶細(xì)胞在工業(yè)上的應(yīng)用酶穩(wěn)定性提高，使生產(chǎn)成本降低反應(yīng)條件的改善和酶壽命的延長(zhǎng)導(dǎo)致生產(chǎn)工藝的技術(shù)革新和改進(jìn)。2、大分子共價(jià)修飾：利用一些可溶性大分子，通過(guò)共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層，形成的可溶性酶具有許多有用的性質(zhì)。例如用聚乙二醇共價(jià)修飾超氧

2、化物歧化酶（SOD），不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長(zhǎng)了半衰期，從而提高了藥效。（四）分子內(nèi)交聯(lián)：增加酶分子表面的交聯(lián)鍵數(shù)目是提高酶穩(wěn)定性的有效方法之一，例如胰凝乳蛋白酶上的羧基經(jīng)過(guò)羰二亞胺活化后，可以與一系列二胺發(fā)生作用，使酶的穩(wěn)定性得到改善。（五）分子間交聯(lián)：利用一些雙功能或多功能試劑將不同的酶交聯(lián)在一起形成雜化酶。例如用戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交聯(lián)在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；將胰蛋白酶與堿性磷酸脂酶交聯(lián)形成的雜化酶可作為部分代謝途徑的模型。（六）脂質(zhì)體包埋：一些醫(yī)藥用酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量較大，不易進(jìn)入人體細(xì)胞內(nèi)，而且在體

3、內(nèi)半衰期短，產(chǎn)生免疫原性反應(yīng)；用脂質(zhì)體包埋法紀(jì)可解決這些問(wèn)題。制止提是天然脂類(lèi)或類(lèi)固醇組成的微球體，酶分子包埋在其內(nèi)部，可以通過(guò)與細(xì)胞的膜融合或內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。（七）反相膠團(tuán)微囊化：這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的酶在有劑相中進(jìn)行催化的技術(shù)，反相膠團(tuán)中酶的穩(wěn)定性大大提高；一些表面活性劑溶解在非極性有機(jī)溶劑中時(shí)可自發(fā)地形成近似球狀的反相膠團(tuán)，反相膠團(tuán)是表面活性劑的疏水尾部朝外而極性頭部朝內(nèi)的微膠團(tuán)，其內(nèi)部可容納一定量的水，酶溶解在其中避免變性（見(jiàn)圖）。加H2O疏水尾部親水頭部加酶液SPEEE圖：反相膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)和酶的分布二、酶分子的內(nèi)部修飾（一）非催化活性基團(tuán)的修飾：通過(guò)對(duì)非催化殘基的修飾可以

4、改變酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，改變酶對(duì)特殊底物的親和力；通?？杀恍揎椀陌被釟埢瓤梢允怯H核的，也可以是親電子的，還可以是是可氧化殘基。（二）酶蛋白主鏈的修飾：主要是靠酶法進(jìn)行修飾，用蛋白酶對(duì)主聯(lián)進(jìn)行部分水解，可以改變酶的催化特性。（三）催化活性基團(tuán)的修飾：通過(guò)選擇性修飾催化活性氨基酸的側(cè)鏈來(lái)實(shí)現(xiàn)氨基酸殘基的取代，使一種氨基酸側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為另一種氨基酸側(cè)鏈，這種方法又稱(chēng)為化學(xué)突變法。（四）肽鏈伸展后的修飾：酶蛋白經(jīng)過(guò)脲、鹽酸胍處理，使肽鏈充分伸展，對(duì)酶分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)進(jìn)行修飾，然后在適當(dāng)條件下，重新進(jìn)行折疊。三、與輔因子相關(guān)的修飾（一）對(duì)依賴(lài)輔因子的酶可用兩種方法進(jìn)行修飾：如果輔因子與酶是非共價(jià)

5、結(jié)合的,可以將輔因子共價(jià)結(jié)合于酶分子上；引入新的具有更強(qiáng)反應(yīng)的輔因子。四、金屬酶的金屬取代：酶分子中的金屬離子可以被其他金屬離子取代，可以改變酶的專(zhuān)一性、穩(wěn)定性等。第二節(jié)酶化學(xué)修飾的基本要求一、被修飾酶的性質(zhì)（一）酶的穩(wěn)定性：包括熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，作用溫度以及pH，酶蛋白解離時(shí)的電化學(xué)性質(zhì)，抑制劑的性質(zhì)等。（二）酶活性中心的狀況：包括酶分子活性中心的組成，如參與活性中心的氨基酸殘基、輔因子等。酶分子的形狀、大小以及寡聚酶的亞基組成。（三）酶?jìng)?cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)與反應(yīng)性1、對(duì)巰基的化學(xué)修飾：常用的修飾試劑有烷化劑、汞試劑和Ellman試劑等。2、氨基的化學(xué)修飾：常用的修飾試劑友乙酸酐、2

6、，4，6-三硝基苯磺酸、2，4-二硝基氟苯、烷基化時(shí)劑、丹磺酰氯(DNS)和苯異硫氰酸酯（PITC)等。3、羧基的化學(xué)修飾：水溶性羰二亞胺或氨化反應(yīng)、硼氟化三甲鋅鹽反應(yīng)、甲醇-鹽酸酯化反應(yīng)等。4、咪唑基的修飾反應(yīng)：焦碳酸二乙酯反應(yīng)、碘代反應(yīng)、碘化反應(yīng)等。5、吲哚基的化學(xué)修飾：2-羥基-5-硝基芐溴、光敏試劑、4-硝基苯硫氯等。6、甲硫氨酸側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾：H2O2、光敏試劑、碘代乙酰胺等7、二硫鍵的化學(xué)修飾：2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、過(guò)甲酸等。8、酚基的化學(xué)修飾：N-乙酰咪唑、碘化反應(yīng)、四硝基甲烷、偶氮化試劑、二異丙基氟磷酸。9、胍基的化學(xué)修飾：丁二酮、1，2-環(huán)己二酮、苯乙二醛等

7、。二、修飾反應(yīng)的條件：修飾反應(yīng)應(yīng)盡量在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡量不破壞酶活性必需基團(tuán)，修飾率高，活力回收要高。（一）pH與離子強(qiáng)度：pH決定了酶分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)，酶的解離狀態(tài)不同，其反應(yīng)性能也不同；另一方面，有些修飾試劑在不同pH下，與同一種基團(tuán)反應(yīng)可以形成不同的產(chǎn)物。離子強(qiáng)度對(duì)修飾反應(yīng)也有重要影響。（二）修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間：嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和時(shí)間可以減少或消除一些非專(zhuān)一性的修飾反應(yīng)。（三）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例：酶與修飾試劑的比例可以控制酶分