豬圓環(huán)病毒pcr檢測(cè)方法的建立

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1、豬圓環(huán)病毒PCR檢測(cè)方法的建立澎江廖種學(xué)2009年第4期豬圓環(huán)病毒PCR檢測(cè)方法的建立王東方.,魏戰(zhàn)勇.,崔保安,陳紅英,郭小參,呂曉麗,管倩(1.河南農(nóng)業(yè)關(guān)學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南鄭州450002;2.河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南鄭州4500023.河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,河南鄭州450o08)摘要:本研究建立了檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的PCR方法,并對(duì)該方法進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化研究.該方法具有快速,敏感,特異性強(qiáng)等特點(diǎn),從PCV2感染的細(xì)胞中可最低擴(kuò)增到0.1ng的DNA,且對(duì)其它病原微生物如PRV,PPV不

2、能檢出.可對(duì)病料,血清提取DNA進(jìn)行檢測(cè),所有程序在5h內(nèi)得出結(jié)果.該方法可用于PCV2感染豬的快速診斷,引種檢疫,分子流行病學(xué)調(diào)查.關(guān)鍵詞:PCR;檢測(cè);豬圓環(huán)病毒中圖分類號(hào):$859.81文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):0528—9017(2009)04.0812.04豬圓環(huán)病毒(porcinecireovirus,PCV)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小的一種脊椎動(dòng)物病毒.根據(jù)PCV的致病性,抗原性及核苷酸序列將PCV分為PCV1和PCV2兩個(gè)基因型.PCV1廣乏存在于豬體內(nèi)及豬源代細(xì)胞系中,無(wú)致病性,不能引起細(xì)胞病

3、變;PCV2具有致病性,主要引起一種新發(fā)現(xiàn)的傳染病——斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaningmultisystemicwastingsyderome,PMWS).PMWS主要以進(jìn)行性消瘦和多系統(tǒng)病理?yè)p傷為特征,已給全球養(yǎng)豬業(yè)造成相當(dāng)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失.據(jù)報(bào)道,1991年P(guān)MWS首發(fā)于加拿大;目前世界其它地方普遍有PMWS發(fā)生的報(bào)道.在我國(guó),郎洪武等首次報(bào)道我國(guó)豬群存在PCV2感染以來(lái),已陸續(xù)有二十幾個(gè)省,自治區(qū),直轄市報(bào)道有豬圓環(huán)病毒的感染一.對(duì)于該病診斷已有病毒分離,免疫熒光法,ELISA方法,

4、免疫組化法等方法.這些方法操作煩瑣,困難,經(jīng)常受到條件制約,原位雜交等.目前廣泛應(yīng)用的PCR具有較高的敏感性和特異性.然而由于不同的引物之間差別較大,以及PCR擴(kuò)增時(shí)各種因素的影響,使得PCR方法的特異性和敏感性各不相同,因此用于診斷時(shí)往往容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果.我們針對(duì)最常見的3種擴(kuò)增PCV2的引物區(qū)域設(shè)計(jì),比較了對(duì)引物的特異性和敏感性,優(yōu)化了PCV2的PCR,診斷方法,建立了檢測(cè)與診斷豬圓環(huán)病毒的PCR方法.這將有助于我國(guó)豬群PCV2疫情的監(jiān)測(cè),也能為控制該病的傳播提供技術(shù)支持.1材料和方法1.1試驗(yàn)

5、材料PCV2為中國(guó)農(nóng)大楊漢春教授惠贈(zèng),豬細(xì)小病毒(PPV),偽狂犬(PRV)均為本室保存之毒種.PK15細(xì)胞(無(wú)PCV1污染)為本室保存.DMEM購(gòu)自華美生物工程公司;葡萄糖胺購(gòu)自Sigma公司;無(wú)菌胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司.pGEM—Teasy載體購(gòu)自Promega公司,TaqDNA聚合酶,dNTPs,Mg2,MarkerDL2000購(gòu)自TaKaRa公司,異硫氰酸胍(GuSCN),飽和平衡酚,酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),氯仿:異戊醇(24:1)等均購(gòu)自上海Sangon有限公司.1

6、.2引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank已發(fā)表的PCV2全基因序列AF027217,選擇ORF1和ORF2設(shè)計(jì)3對(duì)引物pl/P2,P3/P4和P5/P6(表1).引物由上海生物工程公司合成.1.3病毒培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒株及病毒接種無(wú)PCV1污染的50%長(zhǎng)滿的PK15細(xì)胞系單層細(xì)胞(用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),含10%小牛血清,100U青霉素,100g?mL收稿日期:2009.03.21基金項(xiàng)目:河南省杰出人才創(chuàng)新基金項(xiàng)目(0621002100)作者簡(jiǎn)介:王東方(1980一),男,河南新鄭人,碩士,從事動(dòng)物技術(shù)研究工作.注:

7、崔保安系通訊作者,E—mail:baoancui@henau.edu.cn.王東方,等:豬圓環(huán)病毒PcR檢測(cè)方法的建立田鏈霉素),37oC培養(yǎng)18h,當(dāng)細(xì)胞增至80%時(shí)棄去培養(yǎng)液,用Hank's堿性鹽溶液配制的300mmol?L葡萄糖胺37℃作用30min.換新鮮培養(yǎng)液,至細(xì)胞長(zhǎng)滿.細(xì)胞未出現(xiàn)任何特異性病變,仍保持良好狀態(tài),培養(yǎng)72h,用0.25%胰蛋白酶.EDTA消化,盲傳3代后,取培養(yǎng)液一20℃室溫凍融3次.一70℃保存.1.4PCV模板DN的制備參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南所述DNA提取方法進(jìn)行.1.5豬

8、圓環(huán)病毒PCR擴(kuò)增PCV2PCR反應(yīng)采用50反應(yīng)體系,其組份如下:10×PCR緩沖液5tLL,MgC12濃度為4mmol?L～,NTPs濃度為200tLmol?L～,Taq酶1U,引物P1,P2濃度為0.5p.mol?L～,模板5,最后用雙蒸餾水補(bǔ)至50p.L.PCR擴(kuò)增條件為:95oC預(yù)變性5min,按95℃1min,55cI=30s,72oC1min,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán),然后72℃延伸10min,結(jié)束后用0.8%瓊脂糖凝膠(含0.5ttg