分子標(biāo)記技術(shù)的類型原理及應(yīng)用

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1、分子標(biāo)記1.分子標(biāo)記技術(shù)及其定義1974年,Grozdicker等人在鑒定溫度敏感表型的腺病毒DNA突變體時(shí),利用限制性內(nèi)切酶酶解后得到的DNA片段的差異,首創(chuàng)了DNA分子標(biāo)記。所謂分子標(biāo)記是根據(jù)基因組DNA存在豐富的多態(tài)性而發(fā)展起來(lái)的可直接反映生物個(gè)體在DNA水平上的差異的一類新型的遺傳標(biāo)記,它是繼形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記之后最為可靠的遺傳標(biāo)記技術(shù)。廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)分子。通常所說(shuō)的分子標(biāo)記是指以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記。分子標(biāo)記技術(shù)本質(zhì)上都是以檢測(cè)生物個(gè)體在基因或基因型上所產(chǎn)生的變異來(lái)反映基因組之間差異。2.分子標(biāo)記技術(shù)的

2、類型分子標(biāo)記從它誕生之日起,就引起了生物科學(xué)家極大的興趣,在經(jīng)歷了短短幾十年的迅猛發(fā)展后,分子標(biāo)記技術(shù)日趨成熟,現(xiàn)已出現(xiàn)的分子標(biāo)記技術(shù)有幾十種,部分分子標(biāo)記技術(shù)所屬類型如下。2.1建立在Southern雜交基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記技術(shù)(1)RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記；(2)CISH(ChromosomeInSituHybridization)染色體原位雜交。2.2以重復(fù)序列為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)(1)(SatelliteDNA)衛(wèi)星DNA；(2)(MinisatelliteDNA)小衛(wèi)星DNA;

3、(3)SSR(SimpleSequenceRepeat)簡(jiǎn)單序列重復(fù),即微衛(wèi)星DNA。2.3以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)(1)RAPD(RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA；(2)AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性；(3)SSCP(SingleStrandConformationPolymorphism)單鏈構(gòu)象多態(tài)性；(4)cDNA-AFLP(cDNA-AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)cDNA-擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性；(5)

4、TRAP(TargetRegionAmplifiedPolymorphism)靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性；(6)SCAR(SequenceCharacterizedAmplifiedRegion)序列特征化擴(kuò)增區(qū)域；(7)SRAP(SequencerelatedAmplifiedPolymorphism)相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性。2.4以mRNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)(1)ESTs(ExpressedSequenceTags)表達(dá)序列標(biāo)簽；(2)DD(DifferentialDislay)差異顯示；(3)RT-PCR(ReverseTranscriptionPCR)逆轉(zhuǎn)錄PCR；(4)DD

5、RT-PCR(DifferentialDisplayReverseTranscriptionPCR)差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR；(5)RAD(RepresentativeDifferenceAnalysis)特征性差異分析；(6)SAGE(Serialanalysisofgeneexpression)基因表達(dá)系列分析。2.5以單個(gè)核甘酸的變異為核心的分子標(biāo)記技術(shù)SNP(SingleNucleotidePolymorphism)單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記。2.6以特定序列為核心的分子標(biāo)記技術(shù)mtDNA(MitochondrialDNA)線粒體DNA分子標(biāo)記。1.代表性分子標(biāo)記技術(shù)1.1RF

6、LP限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性RFLP(RestrictionFragmentLengthPoly?morphism)作為最早的分子標(biāo)記技術(shù)由Grozdicker創(chuàng)立,并于1980年由Bostein再次提出[3]。其原理是限制性內(nèi)切酶能識(shí)別并切割基因組DNA分子中特定的位點(diǎn),如果因堿基的突變、插入或缺失,或者染色體結(jié)構(gòu)的變化而導(dǎo)致生物個(gè)體或種群間該酶切位點(diǎn)的消失或新的酶切位點(diǎn)的產(chǎn)生。那么利用特定的限制性內(nèi)切酶切割不同個(gè)體的基因組DNA,就可以得到長(zhǎng)短、數(shù)量、種類不同的限制性DNA片段,通過(guò)電泳和Southern雜交轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上,選用一定的DNA標(biāo)記探針與之雜交,放

7、射自顯影后就可得到反映個(gè)體特異性的DNA限制性片段多態(tài)性圖譜。RFLP分析中所使用的探針通常是隨機(jī)克隆的與被檢測(cè)物具有一定同源性的單拷貝或低拷貝基因組片段或cDNA片段。其中cDNA探針保守性較強(qiáng),許多同科物種cDNA探針都可以作為通用探針。RFLP標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是:(1)標(biāo)記廣泛存在于生物體內(nèi),不受組織、環(huán)境和發(fā)育階段的影響。(2)RFLP標(biāo)記的等位基因是共顯性的,不受雜交的影響,可區(qū)分純合基因與雜合基因。(3)可產(chǎn)生的標(biāo)記數(shù)目很多,可覆蓋整個(gè)基因組。但是RFLP標(biāo)記技術(shù)需要酶切,對(duì)DNA質(zhì)量要求高;由于編碼基因