gfp的應(yīng)用概述

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1、GFP的應(yīng)用概述摘要:綠色熒光蛋白（GFP）是活細(xì)胞標(biāo)記不可取少的重要工具。GFP發(fā)色團(tuán)是通過(guò)Ser-Tyr-Gly三肽的自催化環(huán)合、脫氫及空氣氧化生成咪哇酮所生成的。所生成的咪唑酮具有高熒光發(fā)射效率和較長(zhǎng)的熒光壽命。然而，咪唑酮只有在GFP的氫鍵網(wǎng)絡(luò)中才能發(fā)光而在溶液中不發(fā)光。一、GFP的理化性質(zhì)從水母體內(nèi)分離到的GFP基因，長(zhǎng)達(dá)2.6kD，由3個(gè)外顯子組成，分別編碼69、98和71個(gè)氨基酸。GFP本身是一種酸性，球狀，可溶性天然熒光蛋白。AequoriaGFP分子量約27X103,一級(jí)結(jié)構(gòu)為一個(gè)由2

2、38個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽；而RenillaGFP是分子量為54kD的同型二聚體。兩種GFP有不同的激發(fā)光譜，AequoriaGFP在395nm具有最高光吸收峰，肩峰為473nm;RenillaGFP在498nm具有強(qiáng)烈的光吸收，肩峰為470nm。兩種GFP含有相同的生色團(tuán)，發(fā)射光譜基本相同（Amax=508?509nm）。GFP性質(zhì)極其穩(wěn)定，易耐受高溫處理，甲醛固定和石蠟包埋不影響其熒光性質(zhì)。其變性需在90°C或pH<4.0或pH〉12.0的條件下用6mol/L鹽酸胍處理，一旦恢復(fù)中性環(huán)境，或去除

3、變性劑，雖然變性的蛋白質(zhì)并不能完全復(fù)性，但是復(fù)性蛋白質(zhì)同天然蛋白質(zhì)對(duì)溫度、pH變化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是，它們?cè)诤艽蟮膒H范圍內(nèi)（pH7?12.2）的吸收、發(fā)射光譜也是相同的。Reni11aGFP的穩(wěn)定性就更為顯著。它在上述一系列的變性條件下都很穩(wěn)定，不易變性。根據(jù)Sheen等［2］的研究，GFP在受體內(nèi)表達(dá)時(shí)，其穩(wěn)定性并不亞于CAT蛋白，因而可以得到持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的熒光。二、GFP的熒光原理GFP的性質(zhì)和發(fā)射光譜的穩(wěn)定性是同其生色團(tuán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性密不可分的。GFP表達(dá)后折疊，在

4、氧存在的條件下，使66位氨基酸殘基的a、3鍵間脫氫。由65?67位的氨基酸殘基(Ser-Tyr-Gly)環(huán)化為穩(wěn)定的對(duì)輕基苯咪挫啉酮(4-p-hydroxybene-5-imidazolinone),形成生色團(tuán)(基于組成生色團(tuán)的元件不同，可將己知的GFP及其變種分為7種，每一種都有一組不同的焚光激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng))［3-5］。GFP無(wú)需再加任何底物和輔助因子，在紫外或藍(lán)光激發(fā)下就能發(fā)熒光，在450?490nm藍(lán)光激發(fā)下，GFP熒光至少能保持10min以上，不像其他熒光素，熒光容易淬滅。其中，GFP的一個(gè)引人

5、注目的特點(diǎn)，其生色團(tuán)的形成沒(méi)有物種的特異性，可以在翻譯后2?4h通過(guò)自動(dòng)催化作用來(lái)合成。Cubitt等［6］認(rèn)為生色團(tuán)自身環(huán)化的驅(qū)動(dòng)力來(lái)自蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的形成，由此Kolb等［7］提出一個(gè)假說(shuō)，即環(huán)化在新合成的多肽的折疊過(guò)程中進(jìn)行。三、GFP在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用在活體內(nèi)檢測(cè)蛋白與蛋白相互作用，對(duì)我們理解生物學(xué)過(guò)程至關(guān)重要。研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典技術(shù)是酵母雙雜交系統(tǒng)。它是一個(gè)基于轉(zhuǎn)錄因子模塊結(jié)構(gòu)的遺傳學(xué)方法，由Fields和Song等人于1989年首次建立，隨后在蛋白相互作用研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。酵母雙雜

6、交系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，就是將己知蛋白作為誘餌蛋白，在系統(tǒng)中捕獲與其相互作用的蛋白質(zhì)。來(lái)源于水母的GFP在此系統(tǒng)中得到了廣泛應(yīng)用，人們可用它直接監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用?？茖W(xué)家利用兩個(gè)增強(qiáng)型GFP(EGFP)片段重建功能，從而開(kāi)發(fā)出一種新型的報(bào)告系統(tǒng)以應(yīng)用于酵母雙雜交系統(tǒng)。該系統(tǒng)在基因水平上將EGFP片段分別與誘餌蛋白及要捕獲的蛋白融合，在體內(nèi)共表達(dá)，從而研究蛋白與蛋白間的相互作用。與現(xiàn)有的酵母雙雜交系統(tǒng)相比，EGFP系統(tǒng)中的誘餌、靶蛋白載體的報(bào)告基因和復(fù)制控制元件均得到了改進(jìn)。在酵母中，當(dāng)?shù)鞍着c蛋白發(fā)生

7、相互作用時(shí)，分開(kāi)的EGFP能夠重新結(jié)合而發(fā)出熒光。四、GFP的問(wèn)題和展望從1994年Chalfie等首次在果蠟、大腸桿菌等生物體內(nèi)成功表達(dá)GFP基因到現(xiàn)在已有十幾年的歷史，越來(lái)越多的研究人員將其作為又一快速高效的研宄工具。雖然GFP在分子生物學(xué)的眾多研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，GFP本身也將不斷地被改進(jìn)及優(yōu)化，GFP的應(yīng)用在技術(shù)上將出現(xiàn)更多的創(chuàng)新，其應(yīng)用范圍將會(huì)越來(lái)越開(kāi)闊。但在研究中仍然存在著一系列的問(wèn)題，包括：①檢測(cè)靈敏度還有待提高，而且其熒光信號(hào)強(qiáng)度方面的非線性性質(zhì)使得定量非常困難也有待于進(jìn)一步研究。②

8、新生GFP通過(guò)折疊和加工成為具有活性的形式其過(guò)程十分緩慢。⑧紫外激發(fā)對(duì)某些GFP有光漂白和光破壞作用，會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)快速喪失。④多數(shù)生物具有微弱的自發(fā)熒光現(xiàn)象，并有著類似的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，這些熒光背景會(huì)影響某些GFP的檢測(cè)。目前為止.大約有幾十種不同特性的熒光蛋白可供選擇使用，這些蛋白質(zhì)的熒光光譜幾乎覆蓋了整個(gè)可見(jiàn)區(qū)9。一個(gè)好的熒光蛋白需具備以下幾個(gè)特點(diǎn)：抗酸、抗漂白、亮度高、成熟快及單體結(jié)構(gòu)。隨著對(duì)GFP的基礎(chǔ)理論研究的深入，新一代GFP