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1、人自噬基因hATG12轉(zhuǎn)染對(duì)釀酒酵母自噬過程的作用【摘要】目的探討人自噬基因ATG12(hATG12)在酵母自噬過程中的作用。方法轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pESC?URA?EGFP?hATG12(實(shí)驗(yàn)組)或pESC?URA?EGFP(對(duì)照組)的酵母用不同方法誘導(dǎo)自噬后,以熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(EGFP)和含hAtg12的融合蛋白(EGFP?hATG12)在酵母中的表達(dá)與定位;以透射電鏡觀察前自噬體結(jié)構(gòu)、自噬體和自噬小體的分布及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。結(jié)果2組酵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均見熒光,液泡內(nèi)未見熒光,實(shí)驗(yàn)組熒光呈小點(diǎn)狀分布;電鏡下見自噬體由雙層膜囊結(jié)構(gòu)延伸而來,該雙層膜囊結(jié)構(gòu)靠近細(xì)胞膜。液泡內(nèi)自噬小體由單層
2、膜包裹。結(jié)論hATG12參與酵母自噬體最初的形成過程,定位于自噬體外膜上,在自噬體形成后脫離自噬體。自噬體膜最初可能來源于細(xì)胞膜?！娟P(guān)鍵詞】hATG12蛋白質(zhì)類酵母菌釀酒基因轉(zhuǎn)染吞噬作用1962年,Ashford和Porter報(bào)道在電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞自噬現(xiàn)象。近年來由于發(fā)現(xiàn)與自噬相關(guān)的基因,以及自噬在生物體生理和病理等方面的作用,自噬受到高度關(guān)注。自噬基因首先在酵母中發(fā)現(xiàn),隨后在小鼠等哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)其同源基因,說明自噬的分子機(jī)制從酵母到高等真核生物高度保守。筆者采用報(bào)告基因技術(shù),觀察hATG12在酵母自噬過程中的表達(dá)及定位,采用透射電鏡觀察自噬體的結(jié)構(gòu)及其形成過程,進(jìn)而研究hA
3、TG12在酵母自噬過程中的作用。1材料與方法1.1材料1.1.1試劑苯甲基磺酰氟、雷帕霉素(美國Sigma公司)。1.1.2質(zhì)粒和菌株大腸桿菌?釀酒酵母穿梭載體pESC?URA,營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母YPH500(美國Invitrogen公司)。含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因的載體pESC?URA?EGFP和pESC?URA?EGFP?hATG12(由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)。hATG12為本實(shí)驗(yàn)室從正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞中獲得的自噬相關(guān)基因。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pESC?URA?EGFP?hATG12的營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母YPH500和轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pESC?URA?EGFP營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母YPH500也
4、由本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化獲得。實(shí)驗(yàn)分組:轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pESC?URA?EGFP?hATG12的酵母為實(shí)驗(yàn)組,轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pESC?URA?EGFP的酵母為對(duì)照組。1.2方法1.2.1熒光顯微鏡標(biāo)本制備與觀察(1)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在SD(0.67％酵母氮堿,2％葡萄糖,0.13％缺尿嘧啶的氨基酸省卻混合物)培養(yǎng)液中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)早期。(2)4000r/min離心5min。用SG(0.67％酵母氮堿,2％半乳糖,0.13％缺尿嘧啶的氨基酸省卻混合物)洗2次。在SG中培養(yǎng)24h。(3)加雷帕霉素(終濃度0.5μg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)5h。(4)取菌液10μL,滴在載玻片上,蓋上蓋玻片。研究顯微鏡(BX51
5、,日本Olympuse公司)藍(lán)色濾片觀察,數(shù)碼相機(jī)(DP70,日本Nikon公司)照相。1.2.2透射電鏡觀察(1)、(2)同1.2.1,(3)在SG中培養(yǎng)24h后,4000r/min離心5min。用SD(?N)(0.17％酵母氮堿,2％半乳糖)洗2次。加SD(?N)培養(yǎng),加苯甲基磺酰氟(終濃度1mmol/L,以防止自噬小體降解),培養(yǎng)1h和3h取樣。(4)透射電鏡觀察:取菌液1mL離心收集細(xì)胞。2.5%戊二醛固定,4℃過夜。PBS漂洗,30min×4。鋨酸后固定1.5h。PBS漂洗,30min×4。常規(guī)丙酮脫水。滲透:純丙酮Spurr’s樹脂=1∶1,2h;純丙酮Spurr’s樹
6、脂=1∶2,4h;Spurr’s樹脂過夜包埋。超薄切片。醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙染色。透射電鏡(JEM?1200EX,日本電子光學(xué)公司)觀察。2結(jié)果2.1EGFP及EGFP?hATG12在酵母發(fā)生自噬時(shí)的表達(dá)與定位2.1.1熒光顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均觀察到熒光。對(duì)照組熒光較均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中,而實(shí)驗(yàn)組除此之外,細(xì)胞質(zhì)中自噬體呈小點(diǎn)狀分布,液泡中未見熒光。相差顯微鏡下觀察到自噬體結(jié)構(gòu),自噬體較多,其中一些能和熒光顯微鏡圖像中自噬體對(duì)應(yīng)起來,這部分自噬體是由轉(zhuǎn)染的hATG12參與形成的,另一部分未顯示熒光的自噬體由酵母內(nèi)源性ATG12參與形成(圖1)。2.1.2透射電鏡觀察
7、當(dāng)細(xì)胞從營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)液培養(yǎng)后,觀察到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)前自噬體結(jié)構(gòu)(pre?autophagosomestructure,PAS)、自噬體和液泡內(nèi)自噬小體。PAS為游離的雙層膜囊,靠近細(xì)胞膜,自噬體位于PAS的內(nèi)側(cè),由雙層膜包裹,液泡內(nèi)自噬小體由單層膜包裹(圖2)。2.2自噬體膜的來源在細(xì)胞周邊靠近細(xì)胞膜觀察到許多雙層膜囊結(jié)構(gòu)、自噬體和小液泡,這些雙層膜囊結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜相連,可見液泡膜也與細(xì)胞膜相連(圖3)。3討論3.1hATG12在酵母自噬過程中的作用本
