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1、樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫作用作者：張建芳，于文彬，徐修禮，蘇明權(quán)，馬越云，劉家云，丁振若【關(guān)鍵詞】樹突狀細(xì)胞 關(guān)鍵詞:樹突狀細(xì)胞;LAK細(xì)胞;免疫治療 摘要:目的建立體外培養(yǎng)擴(kuò)增樹突狀細(xì)胞（DC）的方法，并觀察其誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫作用.方法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用GM-CSF及IL-4誘導(dǎo)DC產(chǎn)生，用TNF-α和PGE2促進(jìn)其成熟，并用肺癌細(xì)胞系GLC-82可溶性抗原致敏.將成熟DC與自體LAK細(xì)胞混合培養(yǎng)（DC-LAK），用MTT法檢測DC-LAK細(xì)胞及LAK細(xì)胞對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系的殺傷作用.結(jié)果經(jīng)GM-CSF，IL-4，TNF-α，PGE2作用后，細(xì)胞表達(dá)CD1a
2、陽性率為71.0%，CD8350.0%，CD14陽性率低于10.0%，高表達(dá)HLA-Ⅰ，HLA-Ⅱ和CD45，為典型的DC表型特征.DC-LAK和LAK細(xì)胞對(duì)4種腫瘤細(xì)胞（GLC-82，A549，moser和MCF-7）的殺傷率，前者為84.7%，66.9%，49.3%和56.0%，后者為43.5%，31.3%，45.0%和32.4%.結(jié)論成功的誘導(dǎo)出具有典型形態(tài)特征及增強(qiáng)LAK細(xì)胞殺傷活性的DC. Invitrogenerationofhumanblooddendriticcellsforactivetumorimmunotherapy Abstract:AIMToestabli
3、shamethodtoculturedendriticcells（DC）invitroandtoobservetheanti-tumoreffectin-ducedbyDC.METHODSDendriticcellsPBMCstimulatedorsolubleantigenabstractedfromlungcan-cercelllineGLC-82.TNF-αandPGE2ixedcellsedDC-LAK.CytotoxicityofDC-LAKandLAKeasuredbyMTTassay.RESULTSTheculturedDCexpressedHLA-Ⅰ，HLA-ⅡandC
4、D45andpositiveratesofCD1a，CD83andCD14oserandMCF-7）PBMCsuc-cessfully. 0引言 近年來樹突狀細(xì)胞（DC）可有效地遞呈可溶性腫瘤抗原，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤的特異性免疫應(yīng)答，并在臨床取得了成績［1，2］.我們將外周血中貼壁的單個(gè)核細(xì)胞作為DC的前體細(xì)胞，聯(lián)合應(yīng)用一組細(xì)胞因子誘導(dǎo)獲得了純度較高的人樹突狀細(xì)胞，并將之與LAK細(xì)胞結(jié)合，體外誘導(dǎo)產(chǎn)生了相對(duì)高效而特異的抗腫瘤免疫作用. 1材料和方法 1.1材料 基因重組人IL-4，TNF-α和GM-CSF為Promega公司產(chǎn)品，PGE2購自Sigma公司，淋巴細(xì)胞分離液購自上海
5、醫(yī)學(xué)試劑廠，IL-2為本?；蜓芯克a(chǎn)品，抗CD1a-FITC和抗CD83-FITC購自晶美公司，HLA-Ⅰ，HLA-Ⅱ抗體及羊抗鼠-FITC購自北京邦定公司，酶聯(lián)免疫檢測儀為Labsystem產(chǎn)品;CD14/CD45雙色熒光標(biāo)記抗體由西京醫(yī)院免疫科提供.肺癌A549為本校基礎(chǔ)部免疫學(xué)教研室提供;乳腺癌MCF-7細(xì)胞引自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;大腸癌moser細(xì)胞、肺癌GLC-82細(xì)胞為本室保留株.各細(xì)胞系均用含50mL・L-1小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃，50mL・L-1CO2條件下常規(guī)培養(yǎng). 1.2方法 1.2.1腫瘤可溶性抗原提取 收集腫瘤
6、細(xì)胞于低滲條件下反復(fù)凍融4次，以5000r・min-1離心30min，取上清，用考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合法測定蛋白質(zhì)含量，過濾后凍存?zhèn)溆? 1.2.2DC及LAK細(xì)胞的制備 以常規(guī)方法分離PBMC，然后用含100mL・L-1FCS的RPMI1640培養(yǎng)液懸浮，以每孔5×106個(gè)細(xì)胞加入6孔板，于37℃，50mL・L-1CO2條件下貼壁2h，用預(yù)熱的培養(yǎng)液輕輕洗出非貼壁細(xì)胞，調(diào)密度至1×109・L-1，加IL-2300kU・L-1，37℃，50mL・L-1CO2條件下培養(yǎng)，每4d換液1次，為LAK細(xì)胞.貼壁
7、細(xì)胞加完全1640培養(yǎng)液，用100μg・L-1的GM-CSF及1000U・L-1的IL-4聯(lián)合刺激誘導(dǎo)DC分化.DC培養(yǎng)4d，加入GLC-82細(xì)胞可溶性抗原100μg・L-1，6d加TNF-α（1000kU・L-1），PGE2（10μmol・L-1）.10d將DC與LAK細(xì)胞混合培養(yǎng)4h，稱為DC-LAK. 1.2.3細(xì)胞表型分析 收集培養(yǎng)7d的細(xì)胞，直接（抗CD14/抗
