血清清蛋白、γ_球蛋白的分離、提純和鑒定_實(shí)驗(yàn)報(bào)告

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1、專業(yè)資料生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名：學(xué)號(hào)：專業(yè)年級(jí)：組別：生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心WORD完美格式下載可編輯專業(yè)資料實(shí)驗(yàn)名稱(TitleofExperimetn)血清清蛋白、γ-球蛋白的分離、提純與鑒定實(shí)驗(yàn)日期(DateofExperiment)2013-12-11實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)(LabNo.)合作者(Partner)指導(dǎo)老師(Instructor)總分(TotalScore)教師簽名(Signature)批改日期(Date)?????【實(shí)驗(yàn)報(bào)告第一部分（預(yù)習(xí)報(bào)告內(nèi)容）：①實(shí)驗(yàn)原理、②實(shí)驗(yàn)材料（包括實(shí)驗(yàn)樣品、主要試

2、劑、主要儀器與器材）、③實(shí)驗(yàn)步驟（包括實(shí)驗(yàn)流程、操作步驟和注意事項(xiàng)）；評(píng)分（滿分30分）：XX】實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握鹽析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法2、掌握凝膠層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法3、掌握離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法4、掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法5、了解柱層析技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理：1、蛋白質(zhì)的分離和純化是研究蛋白質(zhì)化學(xué)及其生物學(xué)功能的重要手段。2、不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度及等電點(diǎn)等都有所不同。利用這些性質(zhì)的差別，可分離純化各種蛋白質(zhì)。3、鹽析法：鹽析法是在蛋白質(zhì)溶液中，加入無機(jī)鹽至

3、一定濃度或達(dá)飽和狀態(tài)，可使蛋白質(zhì)在水中溶解度降低，從而分離出來。蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，致使蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜減弱乃至消失。中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。4、WORD完美格式下載可編輯專業(yè)資料離子交換層析:離子交換層析是指流動(dòng)相中的離子和固定相上的離子進(jìn)行可逆的交換，利用化合物的電荷性質(zhì)及電荷量不同進(jìn)行分離。2、醋酸纖維素薄膜電泳原理：血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，一般都低于

4、pH7.4。它們?cè)趐H8.6的緩沖液中均解離帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于血清中各種蛋白質(zhì)分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，因而在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此可以將它們分離為清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5條區(qū)帶。實(shí)驗(yàn)材料：人混合血清葡聚糖凝膠（G-25)層析柱DEAE纖維離子交換層析柱飽和硫酸銨溶液醋酸銨緩沖溶液20%磺基水楊酸1%BaCl2溶液氨基黑染色液漂洗液pH8.6巴比妥緩沖溶液電泳儀、電泳槽實(shí)驗(yàn)流程：鹽析（粗分離）→葡聚糖凝膠層析（脫鹽）→

5、DEAE纖維素離子交換層析（純化）→醋酸纖維素薄膜電泳（純度鑒定）實(shí)驗(yàn)步驟：（一）鹽析+凝膠柱層析除鹽：取血清0.8ml，邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液0.8ml，混勻室溫放置10min，4000r/min離心10minWORD完美格式下載可編輯專業(yè)資料上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白)沉淀（含球蛋白）加水0.6ml溶解過葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.0×7cm）過葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.0×7cm）用1ml0.02mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4A

6、C緩沖液洗脫，流出液量約1ml時(shí)開始檢測(cè)蛋白質(zhì)用1ml0.02mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4AC緩沖液(2ml)洗脫，流出液量約1ml時(shí)開始檢測(cè)蛋白質(zhì)磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的峰液12滴收集含有蛋白質(zhì)的峰液12滴繼續(xù)用2ml0.02mol/LNH4AC緩沖液洗滌繼續(xù)用2ml0.02mol/LNH4AC緩沖液洗滌BaCl2檢測(cè)SO42-陰性BaCl2檢測(cè)SO42-陰性用2-3ml0.02mol/LNH4AC緩沖液再生平衡用2-3

7、ml0.02mol/LNH4AC緩沖液再生平衡（一）離子交換層析（純化）：除鹽后收集的球蛋白過DEAE-纖維素層析柱（1.0×6cm）WORD完美格式下載可編輯專業(yè)資料用1ml0.02mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4AC緩沖液(3ml)洗脫，流出液量約1ml開始檢測(cè)蛋白質(zhì)取濃度最高的1管作純度鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳法）磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的洗脫液每管10滴，連續(xù)收集3管除鹽后收集的清蛋白過DEAE-纖維素層析柱（1.0×6cm）DEAE-纖維素柱

8、不用再生，可直接用于純化清蛋白用1ml0.0６mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,用約５mL0.06mol/LNH4AC緩沖液流洗，除去α球蛋白和β球蛋白磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有清蛋白的洗脫液每管10滴，連續(xù)收集2管DEAE-纖維素柱先用6mll.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH4AC溶液流洗，再用10ml0.02mol/LNH4AC緩沖液流洗再生平衡2管均作純度鑒