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《小反芻獸疫核酸疫苗的初步研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文小反芻獸疫核酸疫苗的初步研究姓名：朱學(xué)亮申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：才學(xué)鵬;岳城20090501小反芻獸疫核酸疫苗的初步研究摘要小反芻獸疫是一種急性、烈性、接觸性傳染病，可感染山羊、綿羊、小鹿瞪羚及長(zhǎng)角羚等，發(fā)病率和致死率均非常高，為重大跨國(guó)傳播的動(dòng)物疫病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(O正)列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病。該病的病原為副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)的小反芻獸疫病毒(Pestedespetitsruminantsvirus，PPRV)，其基因組為單股負(fù)鏈無節(jié)段RNA，有
2、六種結(jié)構(gòu)蛋白，分別由六個(gè)基因編碼，從病毒核酸的3’至5’端依次排列為N?PMF-H．L。該病毒只有1個(gè)血清型，但根據(jù)病毒基因組序列差異可將PPRV分為4群，其中3個(gè)群源于非洲，1個(gè)群源于亞洲。目前，在小反芻獸疫流行的國(guó)家，用小反芻獸疫弱毒疫苗接種是控制該病的主要手段。弱毒疫苗具有制備容易，可以大規(guī)模生產(chǎn)，保護(hù)率較高等優(yōu)點(diǎn)，但弱毒株具有毒力返強(qiáng)的可能性而存在安全方面的隱患。因此，研制安全高效的新型小反芻獸疫疫苗，為我國(guó)防制小反芻獸疫做好技術(shù)和物質(zhì)儲(chǔ)備是當(dāng)務(wù)之急。本研究根據(jù)GenBank中登錄的PPRVNigeria75／1基因序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR技術(shù)從
3、PPRVNigeria75／1毒株病毒總RNA分別擴(kuò)增其H和F基因，連接到pGEM-TEasy載體并進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明獲得的F、H基因核苷酸序列分別為l641和I830bp，與GenBank中對(duì)應(yīng)基因的同源性為達(dá)99％以上。另外分別設(shè)計(jì)引物以重組質(zhì)粒pGEM-F、pGEM．H為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得F、H基因的胞外區(qū)FM和HM，然后利用PCR的方法將F、H基因的胞外區(qū)連接。連接產(chǎn)物克隆到pGEM．TEasy質(zhì)粒并測(cè)序鑒定。將pGEM—F、pGEM．H、pGEM．H—FM質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切，回收目的片段，與同樣酶切的pEGFP-N1載體連接，構(gòu)建重組真核表達(dá)
4、載體pEGFP—F、pEGFP．H、pGEM．H～d-FM。將這三種重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，用間接熒光抗體方法檢測(cè)F、H、HM+FM蛋白的表達(dá)情況。熒光顯微鏡鏡檢結(jié)果顯示，三種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)有強(qiáng)熒光信號(hào)，陰性對(duì)照細(xì)胞和pEGFP-N1空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)未觀察到特異性熒光，說明F、H、H～d-FM三種蛋白在細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。提取pEGFP．F、pEGFP-H、pEGFP-HM+FM重組質(zhì)粒，按2009tg／只的劑量經(jīng)肌肉注射免疫健康山羊，同時(shí)設(shè)空白和弱毒疫苗免疫對(duì)照組，在免疫后不同時(shí)間采血進(jìn)行抗體測(cè)定。結(jié)果表明pEGFP．F、pEGFP．H及pE
5、GFP-HM+FM免疫組的山羊血清抗體在免疫后第4周達(dá)到最高峰值，之后逐漸下降，而弱毒疫苗免疫組山羊的抗體在免疫后第3周達(dá)到最高峰值之后開始下降；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)三種重組真核表達(dá)質(zhì)粒免疫組抗體效價(jià)始終高于弱毒疫苗免疫組，這表明這三種重組真核表達(dá)質(zhì)粒具有良好的免疫效果。該研究為小反芻獸疫核酸疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：小反芻獸疫病毒；血凝素基因；融合蛋白基因；真核表達(dá)；核酸疫苗；山羊PreliminaryStudyonNucleicVaccineAgainstPestedesPetitsRuminantsAbstractPestedespetitsruminants
6、(PPR)isanacuteandmgmycontagionsviraldiseasewithahighmorbidityandmortalityratesingoats，sheep，dorcasgazellesandgemsboks．PPRisatransnationallyspreadanimalplagueandwasrecognizedasofficiallyreporteddiseasebyOIE．Pestedespetitsruminantvirus(PPRV)，whichbelongstoParamyxoviridaeandMorbillivir
7、us，hasasingle-strandednegativesenselinearRNAgenome．ThegenomeofPPRVencodessixstructuralproteinswhichisnamedN，P，M，F(xiàn)，HandL．AlthoughPPRVhasonlyoneserotype，foursubtypeshavebeenidentifiedwithinthePPRVaccordingtothevirusgenomesequence．ThreeofthemderilredfromAfricanandonederiredfromAsia．The
8、attenuatedvirusvacc
