酶聯(lián)免疫(elisa)技術(shù)

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1、ELISA技術(shù)ELISA是一種免疫測(cè)定。免疫測(cè)定（immunoassay，IA）是應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)測(cè)定標(biāo)本的方法。在臨床檢驗(yàn)中主要通過(guò)抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。一、抗原抗原是能在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)。抗原進(jìn)入機(jī)體后，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和引起細(xì)胞免疫。在免疫測(cè)定中，抗原是指能與抗體結(jié)合的物質(zhì)。能在機(jī)體中引起抗體產(chǎn)生的抗原多為分子量大于5000的蛋白質(zhì)，例如乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）等。小分子化合物在與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合后能引起機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的，稱為半抗原（hapten）。例如某些激素、藥

2、物等?？乖姆磻?yīng)性取決于抗原決定簇（antigenicdeterminant），或稱為表位（epitope）。一個(gè)抗原分子可帶有不同的決定簇，例如中可帶有等決定簇。二、抗體?1．抗體的結(jié)構(gòu)抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測(cè)定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。Ig由兩個(gè)輕鏈（L）和兩個(gè)重鏈（H）的單體組成。Ig的輕鏈?zhǔn)窍嗤?，有κ（kappa）和λ（Lambda）兩種型別。五類Ig的重鏈結(jié)構(gòu)不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG和IgM的

3、重鏈分別稱為γ（gamma）鏈和μ（mu）鏈。?圖1?IgG的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖①木瓜酶裂解部位；②胃蛋白酶裂解部位圖2重鏈和輕鏈的N端的氨基酸排列順序:因各種抗體而異，稱為可變區(qū)，分別用VH和VL表示。兩者構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合部位，只與相應(yīng)的抗原決定簇匹配，發(fā)生特異性結(jié)合，是抗體專一性結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。?IgG可被木瓜蛋白酶分解為三個(gè)區(qū)段，其中兩個(gè)相同的區(qū)段稱抗原結(jié)合片段（Fab）。每個(gè)Fab都保存結(jié)合抗原的能力，但只有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，是單價(jià)的，與抗原結(jié)合后不出現(xiàn)凝集或沉淀。另一區(qū)段稱Fc段，無(wú)抗體活性，但具有IgG特有的抗原性。IgG可被胃蛋

4、白酶分解為兩個(gè)片段，一個(gè)Fab雙體，稱F（ab'）2，能和兩個(gè)相同的抗原結(jié)合；另一片段類似Fc，隨后被分解成小分子多肽，無(wú)生物活性IgM是由五個(gè)單體組成的五聚體，含10個(gè)重鏈和10個(gè)輕鏈，具有10個(gè)抗原結(jié)合價(jià)，由于空間位置的影響，只表現(xiàn)為五個(gè)抗原結(jié)合價(jià)。IgM分子量約為900000，IgG分子量約為150000。機(jī)體被微生物感染后，先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長(zhǎng)期存在，在疾病痊愈后可持續(xù)數(shù)年之久。2．抗體的產(chǎn)生機(jī)體受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。含有抗體的血清稱為抗

5、血清（antiserum）。每一系B細(xì)胞只產(chǎn)生針對(duì)某一抗原決定簇的抗體。如將多種抗原或含有多個(gè)抗原決定簇的抗原注入機(jī)體，則將由多系的B細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的多種抗體，這些抗體均存在于免疫血清中。免疫測(cè)定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔、羊或馬制得。產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞可在體外與繁殖力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞。將單個(gè)雜交瘤細(xì)胞分離，在體內(nèi)或體外培養(yǎng)而分泌的抗體單克隆抗體（monoclonalantibody，McAb或Mab）。單克隆抗體僅針對(duì)一種抗原決定簇，具有很高的特異性。單克隆抗體通常用抗原免疫小鼠制備。將免疫的脾細(xì)胞（含產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞）與小

6、鼠腫瘤細(xì)胞融合，分離雜交瘤細(xì)胞，接種于小鼠腹腔，產(chǎn)生的腹水中含有濃度很高的單克隆抗體。3．抗原抗體反應(yīng)3.1可逆性抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+Ab→Ag·Ab　抗體的親和力（affinity）是抗原抗體間的固有結(jié)合力，可以用平衡常數(shù)K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]?Ag·Ab的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性，因此可用親和層析法來(lái)提純抗原或抗體。在抗血清中，特異性的IgG

7、抗體僅占總IgG中的極小部分。用親和層析法提取的特異性抗體，稱為親和層析純抗體，應(yīng)用于免疫測(cè)定中可得到更好的效果。3.2?最適比例在恒定量的抗體中加入遞增量的抗原形成抗體復(fù)合物（沉淀）的量見(jiàn)圖3。曲線的高峰部分是抗原抗體比例最合適的范圍，稱為等價(jià)帶（zoneofequivalence）。在等價(jià)帶前后分別為抗體過(guò)剩帶和抗原過(guò)剩帶。如果抗原或抗體極度過(guò)剩，則無(wú)沉淀物形成，在免疫測(cè)定中稱為帶現(xiàn)象（zonephenomenon）?？贵w過(guò)量稱為前帶（prezone），抗原地過(guò)量稱為后帶（postzone）。在用免疫學(xué)方法測(cè)定抗原時(shí)，應(yīng)使反應(yīng)系統(tǒng)中有

8、足夠的抗體量，否則測(cè)得的量會(huì)小于實(shí)際含量，甚至出現(xiàn)假陰性。圖3?3.3?特異性抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所