基于微流控芯片激光誘導熒光檢測系統的研究與應用

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1、基于微流控芯片激光誘導熒光檢測系統的研究與應用基于微流控芯片激光誘導熒光檢測系統的研究與應用基于微流控芯片激光誘導熒光檢測系統的研究與應用【摘要】：微全分析系統的研究是上世紀90年代所提出的全新概念。微流控芯片的加工以微電路加工技術為基礎,以單晶硅片為材質。作為一種分析平臺,微流控芯片實驗室主要以芯片毛細管電泳的形式開始研究。隨著微加工技術的不同發(fā)展,微流控芯片實驗室的研究已經廣泛的涉及到了食品衛(wèi)生、藥物分離、環(huán)境分析、生化分析等幾乎所有的分析領域。微全分析系統已經將化學分析領域所涉及到的各個單元集成在了非

2、常小的芯片上,具有高通量,高精度,高速度的特點。激光誘導熒光檢測器是目前最靈敏,應用最為廣泛的檢測方法之一。因此也是與微流控芯片相匹配研究最多的檢測器。根據光學體統不同,激光誘導熒光檢測器可以分為共聚焦型檢測系統,非共聚焦型檢測系統和正交型檢測系統。本論文基于微流控芯片電泳正交型激光誘導熒光檢測的研制與改進工作入手,完善了微流控芯片激光誘導熒光檢測系統的研究。將垂直檢測,改為側壁檢測,減小了整個分析系統體積；在光電倍增光前端放置了微型小孔,降低了激光器的噪聲,提高了信噪比與檢測靈敏度；開發(fā)了一種新型芯片定位

3、技術,可以避免由于材料或加工芯片的厚度造成的芯片高度定位誤差,不需要人工的反復調整也不需要高成本、高技術的自動調節(jié)系統,保證每一塊芯片相對于光源高度的輕松、簡單、正確定位。將分析對象通過嵌入劑或衍生化反應產生熒光,考察了不同篩分介質對DNA片段的篩分性能,檢測了一段p53基因的堿基突變,建立了分析牛奶中氨基酸含量的檢測方法等。從而實現了微流控芯片激光誘導熒光檢測系統的應用。本論文的主要工作有：第一章簡要地綜述了微流控芯片實驗室的發(fā)展歷史、基本原理、分離模式、聯用檢測技術、應用領域、研究進展以及本論文研究的目

4、的和意義。第二章完善了一種集成化的、可用于微流控芯片電泳檢測的激光誘導熒光檢測系統的研究。制備了蓋片、基片長度不同的玻璃微流控芯片,并將芯片的側壁拋光,使儀器由垂直檢測改為側壁檢測,減少了儀器整體的體積；在光電倍增光前端放置了微型小孔,降低了激光器的噪聲,提高了信噪比與檢測靈敏度；并開發(fā)了一種利用芯片健合面上,蓋片大于基片的部分作為微流控芯片的定位面和支撐面的方法,結合彈簧壓片,實現了芯片的精確定位。以四觸點高電壓系統控制芯片上的進樣和電泳分離操作。激光誘導熒光檢測系統采用正交光路模式,對熒光染料Cy5的檢

5、出限達到10-11mol/L(S/N=3)。第三章利用自由基反應,制備了一種可以用于微流控芯片上快速篩分DNA片段的共聚物。將聚吡咯烷酮(PVP)和羥乙基纖維素(HEC)形成的共聚物作為篩分介質成功的分離了DNA片段。通過改變PVP在聚合物中的比列,在進樣場強為600V/cm,共聚物摩爾比列為PVP:HEC為3：1時,可以實現FX174-HaeⅢdigestDNAmarke的進樣分離分析,將72-1353bpDNA片段總分離分析時間縮短為3min。樣品各片段的分離效率達到2.51×105m-1-3.89×1

6、05m-1。本研究為DNA片段的分離提供了簡便、快速、靈敏的方法。第四章考察了金納米粒子與聚合物的復合體系對DNAmarker的篩分性能。首先將不含金納米粒子(GNPs)的聚合物混合溶液涂覆在芯片內壁,然后在這一體系中加入不同粒徑大小的GNPs再次涂覆在通道內壁,并作為篩分介質,也可以成功的分離FX174-HaeⅢdigestDNAmarker,大大提高檢測信噪比。研究發(fā)現,在簡單超聲處理后,直接混合的聚合物溶液中,加入直徑大小為30nm的GNPs,可以在4分鐘以內,實現樣品DNA片段分離檢測。樣品DNA各

7、個片段遷移時間的RSD值均小于2.51%,分離效率最高8.54×104m-1。本研究拓展了納米材料在微流控芯片電泳中的應用。第五章利用微流控芯片電泳(ME)結合激光誘導熒光檢測(LIF)技術,根據單鏈構象多態(tài)性(SSCP)原理,建立了檢測人類p53基因突變的方法。設計不同堿基長度的p53單鏈序列,針對易突變的外顯子7,8,9進行SSCP分析,分離正常與突變的單鏈DNA序列；研究了篩分介質聚乙烯基氧化物(PEO)的濃度,場強對芯片電泳行為的影響。在PEO濃度為0.5%,分離場強為260V/cm時,100s之內

8、就可以實現樣品p53外顯子7,8,9的正常型與突變型堿基的分離檢測。本研究為p53外顯子的突變檢測提供了快速、簡單、靈敏的方法。第六章建立了一種用于測定牛奶中氨基酸成分的微流控芯片電泳-熒光檢測方法。以硼砂緩沖溶液為背景電解質,經紅敏熒光染料(Cy5)衍生的7種氨基酸在150s內可以得到很好的分離和測定?？疾榱烁鱾€分離參數對分離的影響,得到的優(yōu)化條件為：100mmol/L硼砂-氫氧化鈉溶液(pH9.7)作為緩沖溶