醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)常用方法學(xué)簡(jiǎn)介1

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1、研究技術(shù)（一）光學(xué)顯微鏡技術(shù)（二）電子顯微鏡技術(shù)（三）組織化學(xué)術(shù)（四）免疫組織化學(xué)術(shù)（五）原位雜交術(shù)（六）細(xì)胞和細(xì)胞化學(xué)定量術(shù)（七）組織培養(yǎng)術(shù)（八）放射自顯影術(shù)問(wèn)題解決方法觀察對(duì)象太小放大顯微鏡光線不能透過(guò)觀察對(duì)象切片觀察對(duì)象缺乏反差染色觀察對(duì)象生化成分不同細(xì)胞化學(xué)免疫組織化學(xué)觀察對(duì)象為生活狀態(tài)培養(yǎng)（一）光學(xué)顯微鏡技術(shù)1、一般光學(xué)顯微鏡2、熒光顯微鏡3、相差顯微鏡4、激光掃描共聚焦顯微鏡（二）電子顯微鏡技術(shù)1、透射電子顯微鏡2、掃描電子顯微鏡（三）組織化學(xué)術(shù)1、多糖2、脂類3、酶4、核酸（四）免疫組

2、織化學(xué)術(shù)（五）原位雜交術(shù)（六）細(xì)胞和細(xì)胞化學(xué)定量術(shù)1、顯微分光光度測(cè)量術(shù)2、形態(tài)計(jì)量術(shù)3、流式細(xì)胞術(shù)（七）組織培養(yǎng)術(shù)（八）放射自顯影術(shù)（一）光學(xué)顯微鏡術(shù)lightmicroscope（LM）1石蠟切片①取材Formalin40%,4%②固定BouinFormalin40%25ml苦味酸飽和水溶液75ml冰醋酸5ml③脫水--乙醇、包埋--石蠟④切片6um⑤脫蠟二甲苯→乙醇→水⑥染色HEHematoxylin：核酸RER、RibosomeEosin：蛋白、膜結(jié)構(gòu)（mitochondria、SER、ly

3、sosome）⑦透明、封片3、涂片血涂片精液痰液培養(yǎng)細(xì)胞4、鋪片5、磨片骨和牙需制成磨片、經(jīng)染色后觀察（二）電子顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡（簡(jiǎn)稱電鏡）的發(fā)明和使用，使組織胚胎學(xué)研究?jī)?nèi)容發(fā)生了深刻變化。光鏡分辨率為0.2um，放大倍數(shù)約為1000倍，而電鏡的分辨率為0.2nm，比光鏡高1000倍，可放大幾萬(wàn)倍至幾十萬(wàn)倍，因此電鏡能觀察到更微細(xì)的結(jié)構(gòu)。在電鏡下所見(jiàn)的結(jié)構(gòu)稱為超微結(jié)構(gòu)(ultrastructure)。用于觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，標(biāo)本制備比光鏡的要求更嚴(yán)格，組織塊要更新鮮，體積更小（1mm3），固定常用

4、戊二醛和鋨酸。切片則用超薄切片機(jī)，制成50~80nm的超薄切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，然后在電鏡下觀察并攝片。1、透射電鏡（transmissionelectronmicroscope）用于觀察組織或細(xì)胞表面的微細(xì)結(jié)構(gòu)，標(biāo)本需經(jīng)噴鍍金屬膜特殊處理，然后在掃描電鏡下觀察，在熒光屏上掃描成像，呈現(xiàn)富于立體感的表面圖像，如細(xì)胞表面的微絨毛、纖毛和細(xì)胞伸出的偽足等。2、掃描電鏡（scanningelectronmicroscope)2、冰凍切片組織置入液氮（-196℃）快速凍結(jié)，恒冷切片機(jī)切片、染色。更好

5、保存細(xì)胞內(nèi)酶的活性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)：組織片厚，經(jīng)冷凍后易破壞組織結(jié)構(gòu)2、熒光顯微鏡（fluorescencemicroscope）由光源、濾光系統(tǒng)和顯微鏡三個(gè)部分組成。光源為高壓汞燈，可產(chǎn)生紫外光，標(biāo)本中的自發(fā)熒光物質(zhì)或經(jīng)熒光素染色或標(biāo)記的結(jié)構(gòu)在紫外光激發(fā)下可產(chǎn)生各種顏色的熒光，以此來(lái)研究該熒光物質(zhì)在細(xì)胞和組織中的分布。3、相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)中活細(xì)胞的觀察，可使無(wú)色透明的細(xì)胞鏡下結(jié)構(gòu)反差明顯，圖像清晰。4、激光掃描共聚焦顯微鏡（lasers

6、canningconfocalmicroscope）是近年研制和應(yīng)用的一種新型顯微鏡。它將激光束落在樣品上，并作移動(dòng)掃描，對(duì)樣品內(nèi)某種熒光標(biāo)記的物質(zhì)進(jìn)行二維和三維的動(dòng)態(tài)微量分析測(cè)定?？捎脕?lái)研究活細(xì)胞內(nèi)Ca2、Na+和K+等pH值的動(dòng)態(tài)變化；細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器、細(xì)胞骨架、核酸、蛋白質(zhì)和受體等的定位和定量分析；細(xì)胞膜電位、膜通道及信息傳遞的檢測(cè)；利用激光對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)或染色體作切割、分離和克隆等逐漸成為生物醫(yī)學(xué)研究中重要的研究手段。（三）組織化學(xué)術(shù)（histochemistry）應(yīng)用化學(xué)反應(yīng)與物理反應(yīng)原理檢測(cè)

7、組織或細(xì)胞內(nèi)某種化學(xué)成分并進(jìn)行定位、定量及相關(guān)功能研究的技術(shù)。1、多糖顯示多糖或蛋白多糖的常用方法是過(guò)碘酸—雪夫反應(yīng)(periodicacidSchiffreaction,PAS反應(yīng))。組織或細(xì)胞中的多糖被結(jié)合形成紫紅色沉淀物。此反應(yīng)稱PAS陽(yáng)性反應(yīng)，PAS陽(yáng)性部位為多糖存在部位。2、脂類標(biāo)本用甲醛固定，冷凍切片，用油紅O、尼羅藍(lán)或蘇丹類染料染色，使組織和細(xì)胞中的脂類物質(zhì)顯示相應(yīng)顏色。亦可用鋨酸固定兼染色，脂類呈黑色。3、酶酶細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的基本原理是利用酶對(duì)其相應(yīng)底物的水解、氧化等作用，使底物的反應(yīng)

8、產(chǎn)物被某種捕獲劑捕獲并在原位沉淀，形成有色的終產(chǎn)物，借此測(cè)定該酶在細(xì)胞內(nèi)的分布及活性強(qiáng)弱。4、核酸顯示DNA的傳統(tǒng)方法是Feulgen反應(yīng)（Feulgenreaction），組織切片或細(xì)胞涂片先經(jīng)稀鹽酸處理，使DNA水解，醛基暴露，再用雪夫試劑處理，形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物。（四）免疫組織化學(xué)術(shù)（immunohistochemistry）利用免疫學(xué)抗原和抗體特異性結(jié)合的原理，檢測(cè)組織或細(xì)胞中的多肽和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的分布。為顯示抗原抗體復(fù)合物的存在，需進(jìn)行抗體標(biāo)記；用熒光