豬圓環(huán)病毒3型熒光定量PCR檢測(cè)方法.pdf

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1、ICS11.220B41團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CVMAX8—2019豬圓環(huán)病毒3型熒光PCR檢測(cè)方法Real-timeRT-PCRassayfordetectionofporcinecircovirus3（征求意見(jiàn)稿）CVMA中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)2019-XX-XX發(fā)布2019-XX-XX實(shí)施中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布T/CVMAX8-2019前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)不涉及有關(guān)專(zhuān)利。本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心、中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心、中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：張志、李陽(yáng)、孫學(xué)強(qiáng)、劉爽、徐烽曄、宮楓舉、官麗娟、邵鈺、李翠翠、李曉成

2、、蔣文明、于曉慧、王琳、周曉翠、王團(tuán)結(jié)。CVMA中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)-1-T/CVMAX8-2019豬圓環(huán)病毒3型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬圓環(huán)病毒3型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬圓環(huán)病毒3型的核酸檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求3縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。3.1PCV3：豬圓環(huán)病毒3型（porcinecircovirus3）3.2實(shí)時(shí)熒

3、光PCR：實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timePCR）3.3Ct（或Cp）值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)量達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Thresholdcycle）3.4FAM：羧基熒光素（Carboxyfluorescein）4儀器設(shè)備4.1熒光PCR檢測(cè)儀。4.2臺(tái)式冷凍離心機(jī)：可控溫至4℃、離心速度可達(dá)CVMA12000r/min以上。4.3普通冰箱中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)：2℃~8℃。4.4普通冰柜：-20℃以下。4.5超低溫冰箱：可控溫至-70℃以下。4.6微量移液器：0.1μL~2.5μL、1μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL，并配備與移液器匹配的吸頭

4、。4.7高壓滅菌鍋。5試劑和耗材5.1試劑5.1.1DNA提取試劑盒5.1.2PCV3檢測(cè)引物和Taqman熒光探針，序列如下：上游引物qPCV3-F：5’-CGGAGACGTCGGGAAATCTG-3’；-2-T/CVMAX8-2019下游引物qPCV3-R：5’-CCCCCGTGGCTTGAAATAC-3’；熒光探針qPCV3-Probe：5’FAM-CACCCCGCAAAAATCACGCAAACC-3'BHQ1。5.1.3陽(yáng)性對(duì)照：體外轉(zhuǎn)錄的PCV3陽(yáng)性質(zhì)粒DNA。5.1.4陰性對(duì)照：為已知PCV3陰性的豬組織懸液。5.2耗材5.2.11.5mL離心管。5.2.20.2mLPCR薄壁

5、管或八聯(lián)管。5.2.310-200μL帶濾芯吸頭。6樣品的采集、保存和運(yùn)輸6.1樣品的采集取豬抗凝全血、扁桃體、脾臟、淋巴結(jié)等主要臟器適量（5g~10g）裝入滅菌15mL樣品管中，編號(hào)，備用。6.2樣品的保存上述采集的樣品可立即用于檢測(cè)，不能立即檢測(cè)的樣品，在2℃~8℃條件下不超過(guò)24h，-20℃可以短期保存，-70℃以下可以長(zhǎng)期保存。6.3樣品的運(yùn)輸樣品的運(yùn)輸必須采用低溫保存進(jìn)行運(yùn)輸，并在規(guī)定溫度下的保存期內(nèi)送達(dá)。7實(shí)時(shí)熒光PCR操作程序7.1樣品DNA提取用商品化的DNA提取試劑盒提取樣品的DNA，備用。提取的DNA應(yīng)立即進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，如在4℃保存，不宜超過(guò)8h，如需長(zhǎng)期保存

6、，應(yīng)放置在-20℃或-70℃冰箱中。7.2反應(yīng)體系的配置在反應(yīng)配置區(qū)進(jìn)行。每個(gè)檢測(cè)反應(yīng)體系使用18μL的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)液，分別加入制備的RNA溶液2μL，使每管總體積達(dá)到20μL，編號(hào)，擰緊管蓋后，500r/min離心30s。7.3實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)CVMA在檢中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)測(cè)區(qū)進(jìn)行。在熒光PCR儀上選用FAM通道，設(shè)置如下反應(yīng)參數(shù)：95℃變性3min，然后40個(gè)循環(huán)（95℃8s，60℃15s），60℃采集信號(hào)。8結(jié)果判定8.1閾值設(shè)定閾值設(shè)定原則根據(jù)不同的熒光PCR儀的噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性樣品擴(kuò)增的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。8.2質(zhì)量控制讀取每個(gè)樣品的Ct值，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照

7、有特異性擴(kuò)增曲線而且Ct值≤30，標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照無(wú)特異性擴(kuò)增曲線，說(shuō)明質(zhì)控合格。以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重新進(jìn)行。8.3結(jié)果描述及判定8.3.1被檢樣品有特異性擴(kuò)增曲線，而且Ct值≤35，判定為PCV3核酸陽(yáng)性。-3-T/CVMAX8-20198.3.2被檢樣品無(wú)特異性擴(kuò)增曲線或者Ct值>37，判定為PCV3核酸陰性。8.3.3被檢樣品有特異性擴(kuò)增曲線，而且35