GFP的簡介和應用

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1、GFP的簡介和應用GFP的簡介和應用【摘要】源于多管水母屬等海洋無脊椎動物的綠色熒光蛋白（GFP），是一種極具應用潛力的標記物，有著極其廣泛的應用前景。本文就GFP的理化性質(zhì)、熒光特性、改進以及它在科學研究中發(fā)揮的作用進行了綜述。【關鍵詞】綠色熒光蛋白（GFP）、標記物、熒光特性、進展、改進、應用、干細胞移植【正文】一、GFP的簡介1.GFP的理化性質(zhì)，熒光特性及其改進1.1GFP的理化性質(zhì)從水母體內(nèi)分離到的GFP基因，長達2.6kD，由3個外顯子組成，分別編碼69、98和71個氨基酸。GFP本身是一種酸性，球狀，

2、可溶性天然熒光蛋白。AequoriaGFP分子量約27×103，一級結(jié)構為一個由238個氨基酸殘基組成的單鏈多肽；而RenillaGFP是分子量為54kD的同型二聚體。兩種GFP有不同的激發(fā)光譜，AequoriaGFP在395nm具有最高光吸收峰，肩峰為473nm；RenillaGFP在498nm具有強烈的光吸收，肩峰為470nm。兩種GFP含有相同的生色團，發(fā)射光譜基本相同（λmax=508~509nm）。GFP性質(zhì)極其穩(wěn)定，易耐受高溫處理，甲醛固定和石蠟包埋不影響其熒光性質(zhì)。其變性需在90℃或pH<4.0或pH

3、>12.0的條件下用6mol/L鹽酸胍處理，一旦恢復中性環(huán)境，或去除變性劑，雖然變性的蛋白質(zhì)并不能完全復性，但是復性蛋白質(zhì)同天然蛋白質(zhì)對溫度、pH變化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是，它們在很大的pH范圍內(nèi)的吸收、發(fā)射光譜也是相同的。RenillaGFP的穩(wěn)定性就更為顯著。它在上述一系列的變性條件下都很穩(wěn)定，不易變性。根據(jù)Sheen等的研究，GFP在受體內(nèi)表達時，其穩(wěn)定性并不亞于CAT蛋白，因而可以得到持續(xù)時間較長的熒光。1.2GFP的熒光原理GFP的性質(zhì)和發(fā)射光譜的穩(wěn)定性是同其生色團結(jié)構的穩(wěn)定性

4、密不可分的。GFP表達后折疊，在氧存在的條件下，使66位氨基酸殘基的α、β鍵間脫氫。由65~67位的氨基酸殘基（Ser-Tyr–Gly）環(huán)化為穩(wěn)定的對羥基苯咪唑啉酮（4-p-hydroxybene-5-imidazolinone），形成生色團（基于組成生色團的元件不同，可將已知的GFP及其變種分為7種，每一種都有一組不同的熒光激發(fā)和發(fā)射波長)。GFP無需再加任何底物和輔助因子，在紫外或藍光激發(fā)下就能發(fā)熒光，在450~490nm藍光激發(fā)下，GFP熒光至少能保持10min以上，不像其他熒光素，6GFP的簡介和應用熒光容

5、易淬滅。其中，GFP的一個引人注目的特點，其生色團的形成沒有物種的特異性。可以在翻譯后2~4h通過自動催化作用來合成。Cubitt等認為生色團自身環(huán)化的驅(qū)動力來自蛋白質(zhì)三維結(jié)構的形成，由此Kolb等提出一個假說，即環(huán)化在新合成的多肽的折疊過程中進行。1.3GFP的熒光性質(zhì)及應用優(yōu)點GFP的熒光性質(zhì)比較特殊，具有諸多優(yōu)點而備受關注。（1）易于檢測，靈敏度高。GFP熒光反應不需要外加底物和輔助因子，只需紫外光或藍光激發(fā)，即可發(fā)出綠色熒光，用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到。其次，即便是未經(jīng)純化的GFP發(fā)射的綠光也是相當強

6、的，在正常室內(nèi)光線下仍清晰可辨。對于單細胞水平的表達也可識別。（2）熒光性質(zhì)穩(wěn)定。GFP對光漂白（一種熒光衰減現(xiàn)象）有較強的耐受性，能耐受長時間的光照，從而延長了可探測時間；GFP在pH7~12范圍內(nèi)也能正常發(fā)光，對高溫（70℃）、堿性、除垢劑、鹽、有機溶劑和大多數(shù)普通酶都有較強抗性。（3）對細胞無毒害。從目前的研究結(jié)果來看，GFP對生活的細胞基本無毒害，與目的基因融合后，對目的基因的結(jié)構功能沒有影響，轉(zhuǎn)化后細胞仍可連續(xù)傳代。（4）構建載體方便。由于編碼GFP的基因序列很短，所以很方便地同其它序列一起構建多種質(zhì)粒，

7、而不至于使質(zhì)粒過大影響轉(zhuǎn)化頻率。（5）可直接用于活細胞測定。GFP是能在異源細胞內(nèi)表達后，能自發(fā)產(chǎn)生熒光的蛋白，并且GFP的分子量較小，N-端和C-端都能忍受蛋白的融合，是理想的標記物，可進行活細胞實時定位觀察，更能接近自然真實的狀態(tài)。如在活細胞中直接觀察蛋白向細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運動的狀態(tài)，還可實時觀察到外界信號刺激下，目的蛋白的變化過程，借助熒光顯微鏡觀察，使研究更為方便。使用激光共聚焦顯微鏡，其圖像效果更佳，結(jié)合現(xiàn)代的計算機軟件，可進行三維顯示。（6）不受假陽性干擾。由于其他生物本身不含有GFP，因此不會出現(xiàn)假陽性

8、結(jié)果，GFP作為分子探針可以代替熒光染料，避免由于染料擴散造成的定位不準，使結(jié)果真實可靠。（7）廣譜性。6GFP的簡介和應用表現(xiàn)在GFP的表達幾乎不受種屬范圍的限制，在微生物、植物、動物中都獲得了成功的表達，其次是GFP沒有細胞種類和位置上的限制，在各個部位都可以表達發(fā)出熒光。（8）易于得到突變體。如GFP中氨基酸的替換可產(chǎn)生不同光譜特性的突變體，且增強了熒