管 式 凝 膠 等 電 聚 焦》 課件.ppt

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1、《管式凝膠等電聚焦》1、實驗原理：每一種兩性化合物例如蛋白質(zhì)等都有一個等電點PI,當(dāng)溶液的pH=PI時，該兩性化合物所帶的凈電荷為零。PH＞PI時兩性化合物帶負(fù)電荷，反之兩性化合物帶正電荷。在電場的作用下，帶正電荷的顆粒向負(fù)極移動，帶負(fù)電荷的顆粒向正極移動。當(dāng)將兩性化合物置于由兩性載體所建立起來的pH梯度體系中進(jìn)行電泳時，各種兩性化合物就將分別聚集在相當(dāng)其等電點的pH位置,這即為等電點聚焦。因為不同的兩性化合物其等電點不同，因而可以達(dá)到分離的目的。在實驗過程中，往往由于通電時產(chǎn)生的熱量引起溶液的對流致使已分離的區(qū)帶重新混合，因此在電泳中需要有抗電流的穩(wěn)定介質(zhì)，采用聚丙烯酰胺

2、凝膠作為穩(wěn)定介質(zhì)的既稱為凝膠等電聚焦，本實驗采用圓盤電泳裝置進(jìn)行實驗，因此亦稱為管式凝膠等電聚焦。聚丙烯酰胺凝膠有光聚合和化學(xué)聚合兩種方法，本實驗采取光聚合法。加樣有在單體聚合后加樣或是先將樣品混合在單體配制溶液中，然后使單體聚合兩種，本實驗采用后一種。在聚焦以后，通過對凝膠固定或光密度掃描的方法，將樣品帶顯示出來，然后再與未經(jīng)固定的參比凝膠管測出的pH梯度曲線比較，而對應(yīng)出樣品帶所處的相當(dāng)其等電點的pH值。4、試劑與配制：4-1、實驗試劑：（1）、考馬斯亮蘭—G250（2）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）（3）、牛血清白蛋白（BSA）（4）、兩性載體(AmphalinepH4-

3、10）（5）、丙烯酰胺（Acr）（6）、三氯醋酸（TCA）（7）、乙二胺（8）、核黃素（9）、磷酸4-2、試劑的配制：（1）、丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）溶液的配制：分別按表1.比例稱取丙烯酰胺（Acr），1.6克和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）48毫克于25毫升小燒杯中，加蒸餾水10毫升，溶解即可。（2）、4%核黃素溶液的配制：稱取核黃素4毫克，加蒸餾水100毫升，溶解即可。（3）、兩性載體的配制：直接取Amphaline40%原液。（4）、測試的樣品溶液的配制：稱取牛血清白蛋白2.0毫克，加蒸餾水2.0毫升，溶解即可（濃度為：mg/ml）。（5）、5%磷酸溶液

4、[上電極槽溶液（正極）]的配制：吸取磷酸5毫升，加蒸餾水95毫升，混勻即可（另還用作調(diào)PH用）。（6）、5%乙二胺溶液[下電極槽溶液（負(fù)極）]的配制：吸取乙二胺溶液5毫升，加蒸餾水95毫升，混勻即可。（7）、凝膠固定溶液（15%TCA）的配制：稱取三氯醋酸15克，溶于100.0ml蒸餾水,混勻即可。5、操作步驟：5-1、凝膠系統(tǒng)的配制：表1：凝膠系統(tǒng)溶液的配制方法表（吸取量:3根管/組）試劑名稱比例（%）用量說明丙烯酰胺（Acr）8.0010.0ml合1.6g甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.2448mg核黃素0.0015.0ml見配制Amphaline-40%（pH4-10）1

5、.000.5ml見配制牛血清白蛋白0.012.0ml見配制加蒸餾水后總體積（g/100ml）20.0ml5-2、凝膠的聚合：（屬光聚合法）每組同學(xué)輪流排隊加膠，不得各自分裝以免浪費（1）、將清潔、干燥的小玻管一端，用膠布貼封后，朝下垂直放入有機(jī)玻璃凝膠玻管架的孔中，并在小玻管的8.0cm處作一記號。（2）、用自動取液器（1000ul）或注射器吸取上述配好的凝膠溶液沿著小玻管內(nèi)壁小心準(zhǔn)確加入8.0cm高。（3）、凝膠加畢后，隨即用注射器吸取蒸餾水，加至管中的凝膠表面（1.0cm），使其表面覆蓋一水層。（4）、然后將凝膠管隨支架一同移入日光燈箱內(nèi)進(jìn)行光聚合約一小時。在聚合一開始

6、，管中的界面漸至消退，待膠體形成后，又將重新可辨（一般30分鐘左右即可），此時表明膠體已經(jīng)凝聚。5-3、聚焦：5-3-1、凝膠管的安裝：（1）、取出并選擇合適的聚合完畢的凝膠管，然后棄去凝膠管底端膠布，并倒去管端內(nèi)的溶液。（2）、用滴管分別吸取的上電極槽溶液和下電極槽溶液洗滌凝膠管的上端和下端的凝膠表面。（3）、將凝膠管的上端統(tǒng)一插在上電極槽底板的各同心橡皮圈孔中（注意密封）5-4、加電極溶液：先用滴管吸取上電極槽溶液，在每凝膠管上端逐一加滿，然后在上、下兩極槽內(nèi)分別加入各自的上、下電極槽溶液。其用量，上電泳槽以電極完全浸入為宜，下電泳槽以凝膠管盡可能全浸入為宜。提示：在加

7、入電極溶液時一定要避免或排除上、下玻管口內(nèi)所留有的氣泡，另外上、下電極槽內(nèi)的電極溶液不得加錯。5-5、電泳：將上、下電泳槽對合好，上電極槽電極接電源的正極，下電極槽電極接電源的負(fù)極，使起始電壓調(diào)約為200伏，10分鐘后，將電壓調(diào)至250伏特，并在室溫下恒壓不變，在此條件下聚焦約2小時，即可。5-6、取出玻管內(nèi)的凝膠：（又稱剝膠）將一支帶有長針頭的注射器吸有適量水（蒸餾水或自來水），把針頭慢慢插入玻管內(nèi)壁和凝膠柱表面之間，一邊開始壓水，一邊同時使針頭慢慢貼緊管壁呈螺旋式前進(jìn)，如果一端不行，再在管的另一端按同樣的方法剝