第七章酶分子工程-化學(xué)修飾

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1、第七章酶的分子工程之二：酶蛋白的化學(xué)修飾酶修飾的方向1．核酸水平2．蛋白質(zhì)水平本章主要介紹第二個(gè)部分一、酶蛋白的化學(xué)修飾酶的化學(xué)修飾主要是利用修飾劑所具有的各類化學(xué)基團(tuán)的特性，直接或經(jīng)一定的活化步驟后與酶分子上的某種氨基酸殘基產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，從而改造酶分子的結(jié)構(gòu)與功能。二、酶的分子修飾的目的：1.研究酶的結(jié)構(gòu)與功能2.增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性3.維持酶結(jié)構(gòu)功能的完整性與抗蛋白水解酶4.消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境SOD：對普通非活性部位賴氨酸中∈—氨基的修飾在保留原有的生物活性，穩(wěn)定性增強(qiáng)

2、、在體內(nèi)半衰期長，由6min-15min,延長到15hr以上。SOD的化學(xué)修飾可以增強(qiáng)SOD構(gòu)象的穩(wěn)定性、抗蛋白水解酶的能力及消除對人體的免疫原性。真正能夠產(chǎn)生抗氧化、抗衰老、抗輻射、抗炎、祛班美容等功效。具體說來，如：提高酶活力改進(jìn)酶的穩(wěn)定性允許酶在一個(gè)變化的環(huán)境中起作用改變最適pH值或最適溫度改變酶的特異性；使它能催化不同的底物，使之轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物改變催化反應(yīng)的類型提高催化過程的反應(yīng)效率等等三、影響蛋白質(zhì)化學(xué)修飾反應(yīng)進(jìn)程的因素（一）影響蛋白質(zhì)功能基反應(yīng)性的因素微區(qū)的極性氫鍵效應(yīng)靜電效應(yīng)位阻效應(yīng)蛋

3、白質(zhì)功能基的超反應(yīng)性微區(qū)的極性微區(qū)的極性是決定基團(tuán)解離狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。介質(zhì)極性降低，pK升高：乙酸：水?80%乙醇?100%乙醇pK：4.766.8710.32從整體來看，局部極性的改變對色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸反應(yīng)性的影響最?。粚Π被徒M氨酸反應(yīng)性的影響較大；對酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反應(yīng)性影響最大。極性對整個(gè)反應(yīng)速度的影響還與反應(yīng)的類型有密切關(guān)系靜電效應(yīng):不同蛋白質(zhì)中的組氨酸殘基的pK值是不同的。例如，碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4個(gè)組氨酸殘基，其pk值是：碳酸酐酶：5.91；6.04；

4、7.00；7.23葡萄球菌核酸酶：5.37；5.71;5.74；6.50組氨酸殘基在這兩個(gè)蛋白質(zhì)中的pK值范圍是5.37～7.23，幾乎相差2個(gè)pH單位。模型化合物的數(shù)據(jù)指出，這些變化可能是由于帶電基團(tuán)相互影響所致。位阻效應(yīng)：處于蛋白質(zhì)表面的功能基，：一般說來比較容易與修飾劑反應(yīng)。但是，如果烷基在空間上緊靠功能基，會使修飾劑不能與功能基接觸，這時(shí)就要出現(xiàn)位阻效應(yīng)。對枯草桿菌蛋白酶：它的所有的10個(gè)酪氨酸殘基均在蛋白質(zhì)分子表面，而且其羥基幾乎在所有情況下都沒有形成氫鍵。但是，如果對它進(jìn)行徹底硝化和

5、碘化后，10個(gè)酪氨酸中，只有8個(gè)被修飾。這種情況很可能是空間障礙引起的。蛋白質(zhì)功能基的超反應(yīng)性超反應(yīng)性：蛋白質(zhì)的某個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)與個(gè)別試劑能發(fā)生非常迅速的反應(yīng)。多數(shù)蛋白質(zhì)的功能基與簡單氨基酸中的同樣基團(tuán)相比，反應(yīng)性要差。但是，每個(gè)蛋白質(zhì)分子中至少有一個(gè)基團(tuán)對一定的試劑顯示出超反應(yīng)性。酶的催化活性基團(tuán)通常對修飾劑是有反應(yīng)性的，但酶的超反應(yīng)基團(tuán)不一定是酶活性部位上的基團(tuán)，可能與酶的功能或構(gòu)象沒有明顯聯(lián)系。例如，木瓜蛋白酶中的19個(gè)酪氨酸殘基中，只有一個(gè)能與二異丙基氟磷酸酯反應(yīng)，修飾后酶活性并不改變。還有

6、幾種因素也能改變蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)性，如電荷轉(zhuǎn)移，共價(jià)鍵形成，金屬螯合旋轉(zhuǎn)自由度等。（二）修飾劑反應(yīng)性的決定因素選擇吸附靜電相互作用位阻因素催化因素局部環(huán)境的極性選擇吸附化學(xué)修飾前，修飾劑是根據(jù)各自的特點(diǎn)，選擇性地吸附在低或高極性區(qū)的，有時(shí)可以根據(jù)對速度的飽和效應(yīng)，檢測出蛋白質(zhì)-修飾劑復(fù)合物的形成。正象酶-底物復(fù)合物那樣，蛋白質(zhì)-修飾劑復(fù)合物形成后，修飾過程的速度加強(qiáng)了。這種速度加強(qiáng)，部分是由于選擇性吸附的結(jié)果。靜電相互作用帶電的修飾劑能被選擇性地吸引到蛋白質(zhì)表面帶相反電荷的部位。靜電相互作用可

7、使修飾劑向多功能部位中的一個(gè)殘基定位，或向雙功能基的一側(cè)定位。此外，靜電排斥力能抑制修飾作用位阻因素蛋白質(zhì)表面的位阻因素，或者底物、輔因子、抑制劑所產(chǎn)生的位阻因素都可能阻止修飾劑與功能基的正常反應(yīng)。如果修飾劑的大小超過這個(gè)部位的大小，則不能發(fā)生修飾反應(yīng)催化因素修飾部位附近的其它功能基，如果起一般的酸堿催化作用，也能影響修飾反應(yīng)。不同的修飾劑，其反應(yīng)速度和反應(yīng)部位有明顯差異。例如、對硝基苯乙酸鹽和苯乙酸鹽對胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸的乙?；瘜儆谕粰C(jī)理，但苯乙酸鹽的反應(yīng)性差，這在較大程度上與酶的酸堿

8、催化有關(guān)。局部環(huán)境的極性許多有機(jī)反應(yīng)的速度與溶劑的極性有關(guān)，而有些反應(yīng)則與極性無關(guān)。溶劑效應(yīng)是很復(fù)雜的四、設(shè)計(jì)酶的化學(xué)修飾（一）對酶性質(zhì)的了解酶的活性中心酶的穩(wěn)定條件最佳反應(yīng)條件酶的側(cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)等等（二）修飾劑的選擇實(shí)際要根據(jù)修飾目的來選擇：1）：如：對氨基的修飾可有幾種情況：修飾所有氨基，而不修飾其它基團(tuán)；僅修飾α-氨基；修飾暴露的或反應(yīng)性高的氨基以及修飾具有催化活性的氨基等。修飾的部位和程度一般可用選擇適當(dāng)?shù)脑噭┖头磻?yīng)條件來控制。1.選擇修飾劑要考慮的問題2）：如果修飾目的是希望改變蛋白質(zhì)