溶藻細(xì)菌h5對(duì)漢斯冠盤(pán)藻溶藻特性探究

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1、溶藻細(xì)菌H5對(duì)漢斯冠盤(pán)藻溶藻特性探究　　摘要：為了進(jìn)一步研究溶藻細(xì)菌H5的溶藻特性，采用透析、乙醇沉淀、有機(jī)溶劑萃取、酸堿穩(wěn)定性分析等方法探討了H5溶藻活性物質(zhì)的特性。結(jié)果表明，H5的溶藻活性物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量在3.5～7.0ku之間，不能用乙醇沉淀法完全分離，具有較好的親水性，在pH4～7的酸性范圍內(nèi)溶藻能力較強(qiáng)。H5無(wú)菌濾液使?jié)h斯冠盤(pán)藻（Stephanodiscushantzschii）藻細(xì)胞丙二醛含量顯著上升，SOD活力在處理0～196h內(nèi)急劇上升，隨后下降，由此推測(cè)該活性物質(zhì)能使藻細(xì)胞發(fā)生膜脂過(guò)氧化，從而破壞了膜的完整性。關(guān)鍵詞

2、：溶藻細(xì)菌；溶藻活性物質(zhì)；溶藻特性；漢斯冠盤(pán)藻（Stephanodiscushantzschii）中圖分類(lèi)號(hào)：X172文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114（2013）13-3011-0412富營(yíng)養(yǎng)化已成為眾多水體普遍存在的環(huán)境問(wèn)題。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，日益增加的工農(nóng)業(yè)污染連同大型水利建設(shè)可能使我國(guó)的許多河流的富營(yíng)養(yǎng)化水平進(jìn)一步升高。自20世紀(jì)90年代以來(lái)漢江中下游及其支流多次暴發(fā)早春硅藻水華[1]；三峽工程建成蓄水后不久，香溪河、大寧河等主要支流庫(kù)灣每年春季暴發(fā)硅藻、甲藻水華[2]。水華發(fā)生時(shí)水色呈現(xiàn)褐紅色、或深或淺的醬油色，并伴

3、有腥味，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)鼐坝^和生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能[3]。面對(duì)日益嚴(yán)重的水華問(wèn)題，在物理、化學(xué)和其他生物方法除藻效果不甚理想的情況下，研究利用溶藻細(xì)菌防治水華和赤潮成為一個(gè)新的方向，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。溶藻細(xì)菌是水華或赤潮發(fā)生時(shí)伴隨的一類(lèi)細(xì)菌，是一類(lèi)以直接或間接方式抑制藻類(lèi)生長(zhǎng)或殺死藻類(lèi)、溶解藻細(xì)胞細(xì)菌的統(tǒng)稱(chēng)[4]。不少研究者認(rèn)為水華和赤潮的消亡都可能與溶藻細(xì)菌的溶藻功能有關(guān)[4，5]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)溶藻細(xì)菌的研究主要集中在溶藻細(xì)菌的分離、藻菌的相互作用和胞外分泌物對(duì)藻細(xì)胞的作用[5，6]，但對(duì)于胞外分泌物的性質(zhì)和溶藻作用機(jī)制缺乏深

4、入研究。大多數(shù)溶藻細(xì)菌的研究都是針對(duì)藍(lán)藻水華[5-7]，而對(duì)于控制硅藻水華的溶藻細(xì)菌的研究則鮮見(jiàn)報(bào)道。三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部工程研究中心水污染控制實(shí)驗(yàn)室前期從三峽水庫(kù)香溪河庫(kù)灣爆發(fā)硅藻水華的水體中篩選出1株溶藻細(xì)菌H5，并鑒定為紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillusfusiformis），其溶藻方式是間接溶藻，即分泌溶藻物質(zhì)于胞外，抑制藻類(lèi)的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)通過(guò)進(jìn)一步研究溶藻細(xì)菌H5對(duì)漢斯冠盤(pán)藻（Stephanodiscushantzschii）的溶藻方式、胞外活性物質(zhì)的基本化學(xué)性質(zhì)和作用，以期為研制高效的生物化學(xué)除藻劑提供基礎(chǔ)

5、。121材料與方法1.1藻種來(lái)源及培養(yǎng)試驗(yàn)所用藻種為漢斯冠盤(pán)藻，藻種經(jīng)活化后，在（15±1）℃、光照度為2500lx、光暗周期比12h∶12h的培養(yǎng)條件下，采用DM液體培養(yǎng)基[8]，置于恒溫光照生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，間或振蕩。藻種的接種及傳代過(guò)程中均嚴(yán)格按照無(wú)菌操作規(guī)則進(jìn)行。采用血球計(jì)數(shù)板對(duì)漢斯冠盤(pán)藻細(xì)胞濃度進(jìn)行計(jì)數(shù)。1.2細(xì)菌培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基，分離、純化和保種采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基[9]。1.3溶藻細(xì)菌H5無(wú)菌濾液的制備取50mL溶藻細(xì)菌H5種子液加入到450mLLB培養(yǎng)基中，于25℃、160r/min振蕩培養(yǎng)2d后，以

6、20000g離心30min收集上清液，上清液用0.22μm細(xì)菌濾器過(guò)濾，并通過(guò)固體牛肉膏蛋白胨平板進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，得到H5無(wú)菌濾液。1.4溶藻能力的分析溶藻能力的分析采用Kang等[10]的方法。無(wú)菌濾液、細(xì)菌培養(yǎng)液等試驗(yàn)組樣品按照1∶100的比例接入100mL指數(shù)生長(zhǎng)中期的漢斯冠盤(pán)藻藻液中，對(duì)照組則加入相同體積的新滅菌的LB培養(yǎng)基到指數(shù)生長(zhǎng)中期的漢斯冠盤(pán)藻藻液中，412d后測(cè)定各組漢斯冠盤(pán)藻濃度，然后計(jì)算殺藻率，殺藻率計(jì)算公式為：殺藻率=（1-試驗(yàn)組藻濃度/對(duì)照組藻濃度）×100%。1.5溶藻活性物質(zhì)特性分析1.5.1活性物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)

7、量大小判定活性物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小的分析采用李燕等[11]的方法，略作修改。將500mLH5無(wú)菌濾液經(jīng)65℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至50mL，分別取10mL裝入截留相對(duì)分子質(zhì)量為3.5ku和7.0ku的透析袋中，將透析袋放入蒸餾水中，以20℃、100r/min振蕩透析48h，透析期間每隔12h更換1次蒸餾水。透析完成后，收集袋內(nèi)透析樣并用無(wú)菌水定容至10mL，將此透析樣經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后按體積比1∶100接入100mL指數(shù)生長(zhǎng)中期的漢斯冠盤(pán)藻藻液中，4d后測(cè)定殺藻率。1.5.2活性物質(zhì)乙醇沉淀分析活性物質(zhì)乙醇沉淀分析采用李薔等[12]的方法，略

8、作修改。將H5無(wú)菌濾液加入無(wú)水乙醇于4℃下靜置1h，以4000r/min離心后分別收集上清液和沉淀。將收集的上清液經(jīng)65℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，再次加入無(wú)水乙醇沉淀，將上述步驟再重復(fù)1次。將收集的上清液再經(jīng)6