基因表達(dá)載體構(gòu)建

《基因表達(dá)載體構(gòu)建》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、一、簡(jiǎn)述原核生物和真核生物基因表達(dá)調(diào)控的異同點(diǎn)，并說明基因表達(dá)調(diào)控與基因工程表達(dá)載體構(gòu)建的關(guān)系。1．原核生物和真核生物基因表達(dá)調(diào)控的共同點(diǎn)：（1）結(jié)構(gòu)基因均有調(diào)控序列；（2）表達(dá)過程都具有復(fù)雜性，表現(xiàn)為多環(huán)節(jié)。2．不同點(diǎn)：原核生物：（1）RNA聚合酶只有一種，其σ因子決定RNA聚合酶識(shí)別特異性；（2）操縱子模型的普遍性；（3）阻遏蛋白與阻遏機(jī)制的普遍性（負(fù)性調(diào)節(jié)占主導(dǎo)）；（4）轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)進(jìn)行；（5）轉(zhuǎn)錄后修飾、加工過程簡(jiǎn)單；（6）轉(zhuǎn)錄起始是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。真核基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)：（1）RNA聚合酶有三種，分別負(fù)責(zé)三種RNA轉(zhuǎn)錄，每種RNA聚合酶由約10個(gè)亞基組成；（2）活性染

2、色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；（3）正性調(diào)節(jié)占主導(dǎo)；（4）轉(zhuǎn)錄和翻譯分隔進(jìn)行；（5）轉(zhuǎn)錄后修飾、加工過程較復(fù)雜；（6）轉(zhuǎn)錄起始是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。3.由于基因的表達(dá)調(diào)控受到多種因子的影響，而構(gòu)建基因工程表達(dá)載體時(shí)多是將真和生物的目的基因轉(zhuǎn)入到原核生物載體上表達(dá)，所以應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）外源基因插入序列必須保持正確的方向和閱讀框架。其遺傳密碼不得缺失、遺漏、或錯(cuò)位及錯(cuò)碼。否則會(huì)導(dǎo)致編碼錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)分子，特別是目的基因序列內(nèi)部應(yīng)不含兩端酶切位點(diǎn)的識(shí)別序列。（2）插入的外源基因必須放在原核的啟動(dòng)子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能夠識(shí)別插入的基因。（3）外源基因必須能在大腸桿菌中進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄

3、（如無內(nèi)含子），轉(zhuǎn)錄后的mRNA在菌體必須相當(dāng)穩(wěn)定，并且能有效地進(jìn)行翻譯，轉(zhuǎn)譯的蛋白分子在菌體內(nèi)不致于受菌體蛋白酶的降解。二、目的基因功能和表達(dá)分析的意義是什么？目的基因功能與表達(dá)分析的主要環(huán)節(jié)有哪些？各有什么目的？這些環(huán)節(jié)與基因工程的主要環(huán)節(jié)有什么異同？1．意義：克隆的目的基因只有通過表達(dá)才能探索和研究基因的功能及基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理，明了其利用價(jià)值和途徑。2．主要環(huán)節(jié)：（1）目的基因的獲得和加工：將得到的目的基因通過加工以期能連接到表達(dá)載體上并穩(wěn)定表達(dá)；（2）載體的選擇與加工：根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)條件選擇不同的載體，并對(duì)載體進(jìn)行改造加工，使其滿足高效連接的需要；（3）載體與目的基

4、因的連接：即通過連接反應(yīng)，將載體和目的基因連接形成重組DNA；（4）重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞：通常將重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)進(jìn)行擴(kuò)增和篩選，以期得到大量的單一重組子，便于利用；（5）陽性克隆的篩選與鑒定：在連接產(chǎn)物中既有載體和目的基因的連接，也有載體自連、目的基因自連以及為發(fā)生連接的載體和目的基因，在轉(zhuǎn)化過程中上述各種分子都會(huì)進(jìn)入宿主細(xì)胞，所以需通過篩選鑒定出陽性克隆。3．異同：目的基因功能與表達(dá)分析主要是為了研究目的基因的表達(dá)情況以期為基因工程應(yīng)用打下基礎(chǔ)；基因工程則是將目的基因應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)對(duì)象上以期獲得相應(yīng)的產(chǎn)物或者實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒有什么特點(diǎn)？如何構(gòu)建農(nóng)桿菌Ti表達(dá)質(zhì)粒載體

5、？1.Ti質(zhì)?？煞譃?個(gè)功能區(qū)域：①T-DNA區(qū)(transferred-DNAregion)：T-DNA是根癌農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA；②Vir區(qū)(virulenceregion)：Vir區(qū)上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使根癌農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性；③Con區(qū)(regionsencodingconjugations，接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū))：該區(qū)段上存在與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因，調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移；④Ori區(qū)(originofreplication，復(fù)制起始區(qū))：Ori區(qū)上的基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制。2.農(nóng)桿菌Ti表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建（1）野

6、生型Ti質(zhì)粒的改造野生型Ti質(zhì)粒的改造，主要包括以下幾個(gè)方面：①刪除T-DNA上的tms、tmr和tmt基因；②加入大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記基因，構(gòu)建根癌農(nóng)桿根瘤菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒，便于重組分子的克隆與擴(kuò)增；③引入植物細(xì)胞的篩選標(biāo)記基因，便于轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的篩選；④引入植物基因的啟動(dòng)子和polyA化信號(hào)序列；⑤插入人工多克隆位點(diǎn)，以利于外源基因的克?。虎蕹i質(zhì)粒上的其它非必需序列，最大限度地縮短載體的長(zhǎng)度。（2）中間載體的表達(dá)構(gòu)建為了使Ti質(zhì)粒成為有效的外源基因?qū)胼d體，科學(xué)家們將T-DNA片段克隆進(jìn)大腸桿菌的質(zhì)粒，并插入目的基因，而后通過接合轉(zhuǎn)移將目的基因引入到根癌農(nóng)桿菌的T

7、i質(zhì)粒。帶有重組T-DNA的大腸桿菌衍生載體稱為中間載體。在中間載體中加上能在植物細(xì)胞中表達(dá)的各種啟動(dòng)子，主要包括組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異型啟動(dòng)子三類，它們可使外源基因在植物細(xì)胞中表達(dá)；當(dāng)啟動(dòng)子與顯性選擇標(biāo)記基因及報(bào)告基因連接，構(gòu)成嵌合基因時(shí)，這些標(biāo)記基因同樣能表達(dá)，從而可提供用于篩選和鑒定的表型。（3）植物表達(dá)載體的構(gòu)建中間表達(dá)載體不能將外源基因轉(zhuǎn)化進(jìn)植物細(xì)胞，因此，必須將中間表達(dá)載體引入到上述已改造的受體Ti質(zhì)粒中，并構(gòu)建成能侵