細(xì)菌簡(jiǎn)單染色和革蘭染色

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1、實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色和革蘭染色一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)無(wú)菌操作技術(shù)，掌握細(xì)菌涂片的制作方法。2、掌握細(xì)菌簡(jiǎn)單染色法和革蘭染色法的原理及操作步驟，識(shí)別細(xì)菌的革蘭染色結(jié)果。3、鞏固顯微鏡油鏡的使用方法。二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌生長(zhǎng)于酸性、中性和堿性溶液時(shí)常帶負(fù)電荷，所以通常采用帶正電荷的堿性染料（如美藍(lán)、甲紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等）使其著色。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加易被帶負(fù)電荷的酸性染料（如伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅）著色。簡(jiǎn)單染色法就是只用一種染料使細(xì)菌著色以顯示其形態(tài)的方法。革蘭氏染色法（GramStaining）由丹麥病

2、理學(xué)家ChristianGram于1884年創(chuàng)立，是細(xì)菌學(xué)中很重要的鑒別染色法，因?yàn)橥ㄟ^(guò)此法染色，可將細(xì)菌鑒別分類為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）這兩種類型。革蘭氏染色法之所以能夠?qū)⒓?xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類，是因?yàn)檫@兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分不同。一般認(rèn)為革蘭陰性細(xì)菌的肽聚糖層很薄，脂肪含量高，經(jīng)乙醇處理后部份細(xì)胞壁可能被溶解并改變其組織狀態(tài)，細(xì)胞壁孔徑大，不能阻止溶劑透入，因而將結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物洗去而被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染就染成了紅色；革蘭陽(yáng)性細(xì)菌的肽聚糖層較厚，經(jīng)乙醇處理后

3、使之發(fā)生脫水作用而使孔徑縮小，結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)而不被脫色。雖然如此，革蘭染色的差異并不能完全認(rèn)為是化學(xué)的差別，也有物理結(jié)構(gòu)不同的結(jié)果，因?yàn)榻湍妇?xì)胞壁的成份完全和細(xì)菌不同，但具有革蘭染色陽(yáng)性反應(yīng)。三、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、葡萄球菌、酵母菌、待鑒定的未知菌S1和S3。2、儀器及其他用品：顯微鏡、酒精燈、打火機(jī)、接種環(huán)、載玻片、蓋玻片、擦鏡紙、擦鏡液、吸水紙、鏡油、無(wú)菌牙簽。3、簡(jiǎn)單染液：草酸銨甲紫染液、番紅染液。4、革蘭染液：草酸銨甲紫染液、革氏碘液、95%乙醇溶液、番紅染液四、實(shí)驗(yàn)步驟（

4、一）簡(jiǎn)單染色1、載玻片的處理：從乙醇溶液中取出洗干凈的載玻片，用吸水紙擦干，將要涂菌的部位在酒精燈火焰上烤一下，去除油脂，冷卻待用。2、涂片:左手持菌液試管，右手持接種環(huán)在火焰上灼燒待冷卻后，用接種環(huán)從試管枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液中取一環(huán)菌，于載玻片中央涂成薄層（事先在背面做好標(biāo)記圓圈）即可，或先滴一小滴無(wú)菌水于載玻片中央，用接種環(huán)從斜面上挑出少許，與載玻片上的水滴混合均勻，涂成一薄層。注意在拔或塞試管塞時(shí)，應(yīng)將試管口在火焰處略加燒灼，最后將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。3、干燥：涂片后室溫下自然干燥。4、固定：手持載玻片一端使標(biāo)本

5、面朝上，在酒精燈的火焰外側(cè)快速來(lái)回移動(dòng)2~3次，要求玻片溫度不超過(guò)60℃，以玻片背面觸及手背皮膚不覺(jué)過(guò)燙為宜，放置待冷后染色。固定的目的是殺死微生物，固定其細(xì)胞結(jié)構(gòu)，保證菌體能牢固地粘附在載玻片上，以免水洗時(shí)被水沖掉。5、染色：在固定好的涂片標(biāo)記處滴加1滴草酸銨甲紫染液，染色1min。6、水洗：緩慢沖洗染液，吸干。7、實(shí)驗(yàn)搭檔改用大腸桿菌培養(yǎng)液和番紅染液，同時(shí)操作以上步驟。8、鏡檢：觀察兩個(gè)標(biāo)本，區(qū)分辨別染成的紫色和紅色。（二）革蘭染色1、制片：分別取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、葡萄球菌、酵母菌、未知菌S1和S3的菌液制成涂

6、片，干燥，固定。2、初染：滴加1滴草酸銨甲紫染液，染色1min，水洗，吸干。3、媒染：再加1滴碘液覆蓋涂片1min，水洗。4、脫色：用吸水紙吸去玻片上的殘留水，用滴管滴加95%的乙醇脫色，輕輕搖動(dòng)玻片直至流出的乙醇無(wú)紫色時(shí)，立即水洗。5、復(fù)染：滴加蕃紅染液復(fù)染3min，水洗。6、鏡檢：吸干水后，蓋上蓋玻片觀察標(biāo)本，觀察時(shí)注意細(xì)菌形態(tài)、大小、排列和顏色。（三）選做實(shí)驗(yàn)在干凈的載波片上滴加半滴水，用無(wú)菌牙簽取一點(diǎn)牙垢，涂抹在水滴上，制成涂片后，進(jìn)行革蘭氏染色后觀察。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論1、革蘭染色照片結(jié)果（見(jiàn)下一頁(yè)）（1）枯草

7、桿菌圖1枯草桿菌革蘭氏染色結(jié)果，10×100如上圖所示，枯草桿菌染色結(jié)果為紫色，是革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）。注：圖中紅色箭頭所指的特殊結(jié)構(gòu)——芽孢。（2）酵母菌圖2酵母菌革蘭氏染色結(jié)果,10×100如上圖所示，酵母菌染色結(jié)果為紫色，是革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）。注：圖中紅色箭頭所示為出芽現(xiàn)象。（3）金黃色葡萄球菌圖3金黃色葡萄球菌革蘭氏染色結(jié)果,10×100如上圖所示，金黃色葡萄球菌染色結(jié)果為紫色，是革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）。注：從圖中可以清晰地觀察到葡萄球狀的細(xì)菌形態(tài)。（4）大腸桿菌圖4大腸桿菌革蘭氏染色結(jié)果,10×100如上圖所示

8、，大腸桿菌染色結(jié)果為紅色，是革蘭氏陰性菌（G—）。（5）未知菌液S1圖5未知菌液S1涂片革蘭氏染色結(jié)果,10×100如上圖所示，菌液中有兩種主要的細(xì)菌。注：紅色箭頭所示的未知菌的染色結(jié)果為紫色，是革蘭氏陽(yáng)性菌（G+），由細(xì)菌形態(tài)推測(cè)為一種桿菌；藍(lán)色箭頭所示的未知菌的染色結(jié)果為紅色，是革蘭氏陰性菌（G—），由細(xì)菌形態(tài)推