美洲大蠊抗癌活性成分體外抗氧化活性分析論文

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1、美洲大蠊抗癌活性成分體外抗氧化活性分析論文張成桂，何正春，焦春香，劉光明【摘要】目的研究從美洲大蠊中提取的抗癌活性成分的體外抗氧化活性，并對(duì)其組成進(jìn)行了初步分析。方法采用體外化學(xué)模擬體系研究了美洲大蠊抗癌活性成分體外抗氧化活性，經(jīng)過SDS-PAGE分析和采用Folin-酚法測(cè)定對(duì)抗癌活性成分的組成進(jìn)行初步分析。結(jié)果美洲大蠊中抗癌活性成分在清除二苯基苦味肼基自由基（DPPH·）和·OH自由基的效果和總還原能力均表現(xiàn)出不同程度的量效依賴關(guān)系；清除DPPH·自由基能力的EC50值為0.309mg/ml；清除·OH自由基的EC50值為8.776mg/ml；抗癌活性成分還原力的

2、EC50為1.103mg/ml；經(jīng)過SDS-PAGE分析呈現(xiàn)的抗癌活性成分組成主要由一系列小分子多肽組成的混合物，小分子多肽在抗癌活性成分中的含量為62.7%。結(jié)論美洲大蠊中抗癌活性成分具有抗氧化活性，其活性弱于Vc.freelericanaL.抗癌活性成分由大理學(xué)院藥學(xué)院昆蟲藥物研究實(shí)驗(yàn)室提供，由蜚蠊科蟲體鮮品或干品經(jīng)醇水提取、大孔吸附樹脂柱層析、醇溶劑洗脫精制而成［申請(qǐng)(專利)號(hào)：200810059054.X］，保存于4℃冰箱中備用。1.2試劑、藥品和儀器無水乙醇、H2O2、硫酸亞鐵、水楊酸、冰乙酸、亞油酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、HCl、

3、DPPH(2,2-二苯基-1-苦基苯肼)、Vc、等均為分析純。Ultra-spec2100紫外可見分光光度計(jì)(AmershamBiosciences)、超聲波破碎儀(SONISS公司)、RE-52CS1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮)等。2方法2.1抗氧化活性分析2.1.1清除DPPH·活性的測(cè)定清除DPPH·活性的測(cè)定參照Kim等［4］的方法：二苯基苦味肼基自由基(DPPH·)是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，在517nm波長(zhǎng)處有最大吸收。DPPH乙醇溶液呈紫色，其濃度與吸光度呈線性關(guān)系。在DPPH乙醇溶液中加入抗氧化劑后，抗氧化劑可以與DPPH·結(jié)合或發(fā)生替代，使DPPH·數(shù)

4、量減少，溶液顏色變淺，在517nm波長(zhǎng)處的吸光度不斷減小，直至達(dá)到穩(wěn)定。因此，可以在517nm波長(zhǎng)處檢測(cè)抗氧化劑對(duì)DPPH·自由基的清除效果，計(jì)算其抗氧化能力。首先配制0.2mmol·L-1無水乙醇溶液的DPPH：準(zhǔn)確稱取4.4mgDPPH粉末，用無水乙醇溶解并定容于50ml容量瓶中，搖勻，該試劑現(xiàn)配現(xiàn)用。取不同濃度的樣品溶液各4ml，再加0.2mmol·L-1DPPH2ml溶液。室溫黑暗放置30min后，用相應(yīng)的溶劑做參比，在517nm可見光波長(zhǎng)測(cè)定吸光值分別為A空白和A樣品。根據(jù)公式計(jì)算樣品清除率I(%)=(A空白-A樣品)/A空白×100%；Acontrol=2

5、mlDPPH溶液+4ml無水乙醇的吸光度；Asample=4ml樣品溶液+2mlDPPH溶液的吸光度；Ablank=4ml樣品溶液+2ml無水乙醇的吸光度。以維生素C作對(duì)照比較?？拱┗钚猿煞衷谧杂苫宄蕿?0%時(shí)所消耗的劑量，可以用內(nèi)插法在相應(yīng)的清除率和濃度的曲線上將相應(yīng)的值計(jì)算出來，計(jì)算所得即為EC50。2.1.2對(duì)·OH自由基的清除率測(cè)定清除羥基自由基的測(cè)定參照文獻(xiàn)［5］的方法。利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，但由于·OH具有很高的反應(yīng)活性，存活時(shí)間短，若在反應(yīng)體系中加入水楊酸就能有效地捕捉·OH，并產(chǎn)生有色產(chǎn)物。該產(chǎn)物在510nm處有強(qiáng)吸收，若在此反應(yīng)體

6、系中加入具有清除·OH功能的被測(cè)物，便會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)·OH，從而使有色產(chǎn)物生成量減少。以2.0mmol·L-1FeSO4∶1.0mmol·L-1H2O2∶6.0mmol·L-1水楊酸=1∶1∶1的比例依次加入到燒杯中，振蕩搖勻，配制300ml。于37℃水浴溫浴15min。取10ml試管，每支都加入上述5.0ml溶液，然后分別加入含不同濃度的樣品溶液1.0ml，搖勻，繼續(xù)于37℃水浴加熱15min，待加熱完畢后以超純水調(diào)零，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)于510nm處測(cè)定吸光度Ai,不加樣品只加超純水的試管檢測(cè)吸光度值為A0。以維生素C作對(duì)照比較。根據(jù)下式計(jì)算抗癌活性肽成分對(duì)·OH

7、的清除率：·OH清除率(%)＝(A0-Ai)/A0×100。清除·OH自由基的EC50值的計(jì)算同上。2.1.3還原能力的測(cè)定還原能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)［6］的方法。取不同濃度的樣品溶液各2.5ml，再分別加入2.5ml的0.2mol·L-1，pH6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5ml1%的K3Fe()6溶液，混勻后于50℃保溫20min后再加入2.5ml10%的三氯乙酸溶液，混合后以3000r·min-1離心10min。取上清液5ml，加5ml蒸餾水和lml0.1%的FeCl3，混合均勻，10min后測(cè)定700nm處的吸光度，以80%甲醇為參比。吸光值越大表示