蜈蚣多糖對hela細(xì)胞的增殖抑制作用研究

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1、蜈蚣多糖對Hela細(xì)胞的增殖抑制作用研究李興暖　韓雅莉　余衛(wèi)國【摘要】目的研究蜈蚣多糖對人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞的抑制作用及作用機(jī)制。方法用MTT法檢測蜈蚣多糖對Hela細(xì)胞生長的抑制作用；流式細(xì)胞儀和AnnexinV-FITC/PI雙熒光染色分別檢測蜈蚣多糖對Hela細(xì)胞周期及凋亡情況的影響。結(jié)果在一定濃度范圍內(nèi)蜈蚣多糖可顯著抑制Hela細(xì)胞的增殖，改變Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期，使細(xì)胞阻滯于G2/M期，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)論蜈蚣多糖可能通過改變Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而對Hela細(xì)胞的增殖有一定的抑制作

2、用?！娟P(guān)鍵詞】蜈蚣多糖；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡　　Abstract:ObjectiveToinvestigatetheinhibitoryeffectsofpolysaccharidefromScolopendrasubspinipesmutilans(PSSM)onHelacellsanditsmechanism.MethodsMTTassayetryandAnnexinV-FITC/PIfluorescencestaining.ResultsPSSMcouldobviouslyinhibittheproliferati

3、onofHelacellsatspecificconcentrationrange,changethecellcycleofHelacellsandblockHelacellsatG2/Mphase,andinducecellapoptosis.ConclusionPSSMcaninhibitthegroScolopendrasubspinipesmutilans;Cellcycle;Cellapoptosis　　少棘蜈蚣ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch又名百足,屬節(jié)肢動物門，多

4、足綱，唇足目，螟蚣科動物，為《中國藥典》記載的正品藥材，為我國傳統(tǒng)的鎮(zhèn)痙、通絡(luò)類藥物。祖國醫(yī)學(xué)記載和臨床實(shí)踐均已證明其具有鎮(zhèn)靜熄風(fēng)、通絡(luò)止痛、解毒散結(jié)等藥用功效〔1〕?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)也證明了蜈蚣具有抗腫瘤和抗動脈粥樣硬化等作用〔2,3〕，臨床用于治療腫瘤以及心腦血管病等癥。傳統(tǒng)中藥均以整蟲入藥，但蜈蚣體內(nèi)成分復(fù)雜，且有效成分尚不明了，無法對其藥理作用做進(jìn)一步研究。為了探討蜈蚣抗腫瘤作用，本文以少棘蜈蚣為原料，對其體內(nèi)多糖進(jìn)行了分離純化，并進(jìn)一步對其進(jìn)行了Hela細(xì)胞增殖的作用的研究，為進(jìn)一步探索蜈蚣抑瘤作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

5、　　1材料　　1.1材料　　少棘蜈蚣ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch購自汕頭市恒青藥店，由廣東工業(yè)大學(xué)生藥研究室對其進(jìn)行種類鑒定。人宮頸癌Hela細(xì)胞，由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子病理實(shí)驗(yàn)室提供，微血管內(nèi)皮細(xì)胞MVEC，由汕頭大學(xué)多學(xué)科研究中心提供?！　?.2試劑與儀器　　DEAE-52為TT）、碘化丙啶（PI）均購自Sigma公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司；新生牛血清購自杭州四季青生物有限公司。ThermoLabsystems酶標(biāo)儀（T

6、hermo公司）；ShelLab二氧化碳培養(yǎng)箱；EpicsXL流式細(xì)胞儀（BackmanCoulter公司）；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司）；NikonCoolpix4500數(shù)碼相機(jī)?！　?方法　　2.1蜈蚣多糖(polysaccharidesfromScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch,SSP)的制備少棘蜈蚣87g研缽磨碎，加入1000ml蒸餾水90℃恒溫水浴攪拌4h，過濾，殘?jiān)尤?00ml蒸餾水，重復(fù)上述步驟，過濾，合并濾液，濃縮濾液。取上清液，加5倍體積95％乙

7、醇4℃靜置過夜，離心，去上清液，沉淀用少許蒸餾水溶解。Sevag法去蛋白數(shù)次〔4〕，將去蛋白溶液透析干燥，過DEAE-52離子交換纖維素色譜柱，以0.05，0.1，0.2，0.4和1mol·L-1NaCl進(jìn)行階段洗脫，共得到3個糖峰，其中濃度0.05mol·L-1的NaCl洗脫峰糖含量最高，收集此組分透析干燥，待用。　　2.2Hela和人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Humanmicrovascularendothelialcell,MVEC)的培養(yǎng)取對數(shù)生長期的Hela和MVEC細(xì)胞接種于含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基中，接種濃

8、度為5×105個/ml，置37℃，5％CO2濃度，飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。去原培養(yǎng)基，加入含有SSP濃度分別為0，0.5，1，1.5，2，4μg/ml的維持液（含1.5％小牛血清的1640培養(yǎng)基），置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?！　?.3蜈蚣多糖（SSP）對Hela細(xì)胞增殖的影響取對數(shù)生長期Hela細(xì)胞