胃癌組織中mdm2和rb基因表達及臨床意義論文

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1、胃癌組織中mdm2和Rb基因表達及臨床意義論文【摘要】目的：探討mdm2,Rb基因表達與胃癌發(fā)生及胃癌生物學行為的關系.方法：采用免疫組織化學技術(SP法)檢測18例正常胃黏膜、26例異型增生胃黏膜、18例早期胃癌、38例進展期胃癌患者組織中的MDM2,Rb基因蛋白的表達情況，并與臨床病理特征相比較.在此基礎上，我們通過RNAi技術特異性降低mdm2的表達水平，觀察細胞周期的變化，探討了mdm2作用的分子機制.結果：MDM2蛋白在正常胃黏膜、I型及II型增生胃黏膜、早期胃癌及進展期胃癌組織中的陽性表達率分別為33.3%

2、，40.0%，43.8%，55.6%.freeldm2后可以明顯抑制細胞的增殖.結論：MDM2,Rb的表達可作為判斷胃癌生物學行為的一個指標，對預后有一定的指導意義；特異性降低mdm2的表達可以作為胃癌治療的一個分子靶點.【關鍵詞】胃腫瘤癌前狀態(tài)mdm2基因Rb基因免疫組化RNA干擾細胞增殖0引言胃癌的發(fā)生是一個多階段、多步驟逐漸演進的過程.這一過程中涉及多種癌基因的激活及抑癌基因的失活.mdm2在多種惡性腫瘤中有基因的突變、擴增及過度表達［1］.但mdm2在胃黏膜早期癌變，特別是與抑癌基因Rb在胃黏膜癌變過程中的協(xié)調作

3、用研究較少.因此本研究應用免疫組化法檢測從正常胃黏膜、胃黏膜增生、早期胃癌及進展期胃癌這一序列變化中MDM2和Rb基因的表達，探討兩者與胃癌發(fā)生及胃癌生物學行為的關系.在此基礎上，我們擬進一步分析mdm2對細胞周期的影響.1材料和方法1．1材料①標本:取自河南科技大學第一附屬醫(yī)院2003/2007年胃切除標本100例.其中正常胃黏膜18例，I型增生10例，II型增生16例，早期胃癌18例，進展期胃癌38例.患者術前均未接受化療或放療.所有胃癌病例均經病理證實,并附有完整的臨床病理資料.診斷標準參照全國胃癌協(xié)作組病理組規(guī)定

4、的標準，胃癌組織學類型根據Lauren分型標準，分為兩大類，腸型胃癌40例，彌漫性胃癌16例.②試劑:鼠抗人MDM2mAb抗體、Rb鼠抗人mAb抗體和免疫組化染色SP試劑盒及DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術開發(fā)公司產品公司.MDM2工作濃度為1∶20，Rb為即用型工作液.針對mdm2靶序列AAGACACTTATACTATGAAAG和不針對任何序列的對照雙鏈RNA干涉序列由上海吉瑪基因公司合成.針對mdm2的PCR引物5′CTGTGTTCAGTGGCGATTGG3′，5′AGGGTCTCTTGTTCCGAAGC

5、3′以及GAPDH的引物5′CAATGACCCCTTCATTGACC3′，5′GATCTCGCTCCTGGAAGATG3′交由上海生工生物有限公司合成.SYBRGreen熒光染料購自Takara生物有限公司.胃癌細胞系SGC7901購自上海細胞所.1．2方法1.2.1標本處理所有標本均經40g/L甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片,片厚4μm.載玻片以10g/L多聚賴氨酸(福州邁新生物技術開發(fā)公司產品)預處理.1.2.2免疫組化石蠟切片脫臘至水；擬滴加一抗為MDM2基因蛋白的組織切片用pH6.0枸櫞酸緩沖液高壓熱

6、修復10min，擬滴加一抗為Rb基因蛋白的組織切片用pH8.0EDTA緩沖液高壓熱修復10min；修復后的切片在緩沖液中冷卻后,滴加過氧化物酶阻斷溶液；用50~100mL/L正常山羊血清封閉，滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜；滴加生物素標記的第二抗體，滴加鏈霉菌抗生物素過氧化物酶溶液；DAB顯色.此外用PBS置換一抗作為空白對照，用試劑盒提供的陽性片作陽性對照.MDM2和Rb蛋白表達陽性細胞著色為細胞核及部分胞質內棕黃色顆粒.在光學顯微鏡下每張切片隨機選擇5個區(qū)域進行細胞計數(shù)，每個區(qū)域計數(shù)100個腫瘤細胞，陽性細胞比例超過10

7、%為陽性表達，小于10%為陰性表達.SGC7901細胞在含100mL/L血清的1640培養(yǎng)基，50mL/L的CO2的條件下培養(yǎng).按Lipofectamine2000的說明書操作，將化學合成的siRNA導入7901細胞.轉染24h后，收集細胞，提取RNA，反轉錄成cDNA后進行實時定量PCR檢測干涉效果.為研究干涉mdm2后細胞增殖的變化，將轉染24h后的細胞按每孔1000個細胞均勻鋪至96孔板，分別培養(yǎng)24，48，72h，收集細胞臺盼藍染色后，取樣細胞計數(shù)臺盼藍染色陽性的細胞數(shù)目，統(tǒng)計細胞增殖情況.細胞計數(shù)實驗每孔重復

8、4次.統(tǒng)計學處理：實驗所得的數(shù)據采用χ2檢驗和Spearman等級相關分析，P0.05為有統(tǒng)計學意義.2結果2.1MDM2和Rb在胃癌及癌前病變中的表達MDM2蛋白在正常胃黏膜、I型及II型增生胃黏膜、早期胃癌及進展期胃癌組織中的陽性表達率分別為33.3%（6/18），40.0%（4/10），43.8%（7/16），