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《反義cortactin基因真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、反義cortactin基因真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定許朱定，宋振順，安家澤，李韌，張福琴，竇科峰【關(guān)鍵詞】,基因表達(dá)Constructionandidentificationofrebinanteukaryoticexpressionvectorofhumanantisensecorticalactinassociatedproteingene 【Abstract】AIM:ToconstructarebinanteukaryoticexpressionvectorpcDNA3.0/cortactincontainingfunctionalregionofhuma
2、nantisensecorticalactinassociatedproteingene(cortactin),soastoprovideatoolforthefurtherstudyontheimpactofcortactininhepatocellularcarcinoma(HCC)metastasis.METHODS:TotalRNAethodfromcelllineMHCC97.CDNAplifiedusingreversetranscriptasepolymerasechainreaction(RTPCR).ProductofPCR,amplified
3、bybeingtransformedintoE.coliDh5α,edthatcortactincDNAetastaticHCCcelllineMHCC97;reversetranscriptasepolymerasechainreaction;humancorticalactinassociatedprotein(cortactin) 【摘要】目的：構(gòu)建一個(gè)包含人皮層肌動(dòng)蛋白（cortactin）反義基因的全部功能區(qū)的重組真核表達(dá)載體pcDNA3.0/cortactin，為進(jìn)一步研究人皮層肌動(dòng)蛋白對(duì)人肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移影響的研究奠定基礎(chǔ).方法：Trizol試劑法
4、提取體外培養(yǎng)的人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MHCC97總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）擴(kuò)增目的片段，PCR產(chǎn)物及真核表達(dá)載體分別雙酶切后進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Ecoli.Dh5α擴(kuò)增以獲得重組載體.結(jié)果：RTPCR獲得預(yù)期大小的特異性DNA片段，經(jīng)PCR、雙酶切鑒定及測(cè)序證實(shí)已將人皮層肌動(dòng)蛋白基因cDNA片段正確的反向插入真核表達(dá)載體中.結(jié)論：成功獲得反義pcDNA3.0/cortactin重組質(zhì)粒. 【關(guān)鍵詞】基因表達(dá)；高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MHCC97；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；人皮層肌動(dòng)蛋白cortactin 0引言 原發(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,
5、其侵襲轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)是患者死亡的主要原因.目前國內(nèi)外對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制研究逐步深入.最近人們發(fā)現(xiàn)人皮層肌動(dòng)蛋白cortactin基因?qū)τ谀[癌的轉(zhuǎn)移有重要的促進(jìn)作用.為此，我們利用反義核酸技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.0/cortactin，為后續(xù)的研究將該基因片段轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞株，觀察該基因在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，并對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞功能進(jìn)行研究作好準(zhǔn)備. 1材料和方法 1.1材料高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MHCC97購自上海復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院肝癌研究所；大腸桿菌Ecoli.Dh5α，真核表達(dá)載體pcDNA3.0由第四軍醫(yī)大學(xué)分子生物學(xué)教研室吳元明博士惠贈(zèng).高糖型DMEM培
6、養(yǎng)液為Invitrogen公司產(chǎn)品；新生牛血清系北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；胎牛血清為杭州四季青生物工程材料技術(shù)有限公司產(chǎn)品；胰蛋白酶(Trypsin)為北京原平皓生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；胰蛋白胨(Tryptone)及酵母提取液（YeastExtract）為OXLID公司產(chǎn)品；瓊脂（Agar）為Sanland公司產(chǎn)品；瓊脂糖（Agarose）為上海Yito公司產(chǎn)品；Trizol試劑、Taq酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶（XhoI,BamHI）、pMD18T載體、Trizol試劑為Takana公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒為BioDev公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量抽提試劑盒為
7、Vgene公司.PCR引物：根據(jù)GeneBank中查到的cortactin的mRNA序列，用軟件PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)上下游引物，引物序列如下（劃線部分分別是BamHI和XhoI的堿基識(shí)別序列，斜體部分為保護(hù)序列）：上游引物5＇ATACTCGAGGTGGAACAAGACCGAATGGA3＇；下游引物5＇TAGGATCCATCCCAGCCAAGGGCACATT3＇. 1.2方法 1.2.1高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MHCC97培養(yǎng)將購回的細(xì)胞經(jīng)2.5g/L胰蛋白酶消化傳代，培養(yǎng)于含100mL/L胎牛血清的高糖型DMEM完全培養(yǎng)液中，置于37℃含50mL/LC
8、O2的孵箱中培養(yǎng)，每3d
