雷帕霉素對大鼠內皮祖細胞增殖、凋亡和no分泌的影響論文

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1、雷帕霉素對大鼠內皮祖細胞增殖、凋亡和NO分泌的影響論文【摘要】目的：觀察雷帕霉素對大鼠骨髓來源內皮祖細胞（EPC）增殖、凋亡及一氧化氮（NO）分泌的影響.方法：密度梯度離心法獲得SD雄性大鼠的骨髓EPCs，無菌條件下培養(yǎng)6d；實驗分為5組：對照組及不同濃度（0.1,1.0,10,100μg/L）雷帕霉素組.各組皆于24h后收集標本，MTT法檢測細胞增殖能力，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，硝酸還原酶法檢測培養(yǎng)液中的NO含量.結果：與對照組相比，1.0~100μg/L的雷帕霉素可抑制EPCs增殖及NO分泌

2、，并誘導EPCs凋亡（P0.05），具有濃度依賴性.結論：1.0~100μg/L的雷帕霉素可抑制EPCs的增殖及NO分泌.freelRNA的表達［3-5］.作者擬觀察雷帕霉素對EPC增殖、凋亡及NO分泌能力的影響，旨在為藥物洗脫支架的內皮化延遲提供實驗依據.1材料和方法1.1材料雄性SD大鼠，體質量（100±5）g，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供.試劑和材料：Ficoll淋巴細胞分離液購自中國醫(yī)學科學院生物工程醫(yī)學研究所，胎牛血清為Hyclone產品；M199為Gibco產品，血管內皮生長因子（V

3、EGF）及堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）為美國CYTOLAB產品，雷帕霉素購自福建科瑞藥業(yè)有限公司，NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所，DiIacLDL為美國invitrogen公司產品，FITCUEAI為美國Sigma產品；ApoAlertTMAnnexinV凋亡檢測試劑盒為美國Clontech公司產品.儀器有：熒光顯微鏡（Leica），倒置相差顯微鏡（Olympus），離心機（Sorvall），酶聯免疫檢測儀（美國BioRAD公司），EliteESP型流式細胞儀（美國COULT

4、ER公司），UV22450分光光度計（日本SHIMADZU公司）.1.2方法1.2.1大鼠骨髓EPC的分離頸椎脫臼法處死大鼠，無菌條件下取出四肢長骨，750mL/L酒精內浸泡5min，用含肝素的培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集細胞懸液，以1∶2的比例疊加到Ficoll淋巴細胞分離液上，保持液面清晰，離心（2000r/min）20min，小心吸取中間云霧狀單核細胞層，5倍體積M199重懸，離心（1500r/min）10min，洗滌兩次后棄上清，用含胎牛血清（100mL/L），VEGF（10μg/L）及bFGF

5、（10μg/L）的M199重懸細胞，調整濃度為4×108/L，接種于培養(yǎng)瓶中，取4h未貼壁的細胞，在37℃，50mL/LCO2條件下培養(yǎng).1.2.2EPC的表型鑒定將培養(yǎng)6d的細胞與DiIacLDL(2.4μg/mL)37℃下孵育1h，然后用40g/L多聚甲醛固定10min.PBS液浸洗后將FITCUEAI(10μg/mL)加于上述標本，37℃下孵育1h.用熒光顯微鏡進行鑒定，DiIacLDL和FITCUEAI染色雙陽性細胞為正在分化的EPCs.1.2.3實驗分組細胞培養(yǎng)6d后，用

6、2.5g/L胰蛋白酶、0.2g/L乙二胺四乙酸消化，全培養(yǎng)液重懸呈單細胞懸液后，分別接種于96孔培養(yǎng)板（以1.5×104細胞/孔的密度）及培養(yǎng)瓶（以5×105細胞/瓶的密度）.實驗分為5組：對照組（僅加入全培養(yǎng)液）及不同濃度雷帕霉素（0.1，1.0，10，100μg/L）組.各組皆于24h后收集標本.1.2.4MTT比色法檢測細胞增殖96孔培養(yǎng)板收集的各組標本，每孔加濃度為5g/L的MTT溶液20μL，在37℃，50mL/LCO2孵箱中繼續(xù)孵育4h；終止培養(yǎng)，吸棄上清液，每孔加入150μL的DMS

7、O，振蕩10min，在酶聯免疫檢測儀上490nm波長處測定各孔吸光度（A490），用只加培養(yǎng)液不加細胞的空白孔調零.1.2.5流式細胞儀雙標法檢測細胞凋亡率各組細胞用0.01mol/LPBS沖洗，1.25g/L胰蛋白酶消化收集細胞；離心去除固定液，用含血清培養(yǎng)液洗1遍，用ApoAlertTMAnnexinV凋亡檢測試劑盒染色，5×105細胞用1×Bindingbuffer漂洗1次；細胞重懸于200μL1×Bindingbuffer.加入AnnexinV5μL和碘化丙啶（PI）10μL，室溫避光10

8、～20min，上機（流式細胞儀）測試.AnnexinV+/PI-細胞數量代表凋亡細胞數量.1.2.6NO水平測定采用硝酸還原酶法.每孔吸取上清100μL，按試劑盒說明書檢測各孔上清NO水平.統計學處理:實驗重復8次，數據以x±s表示.應用SPSS10.0進行統計分析，采用單因素方差分析（One,etal.Roleoftheendotheliuminmodulatingneointimalformation:vasculoprotectiveapproachestoattenuat