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《褐飛虱幾丁質(zhì)降解酶系基因家族分析》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、褐飛虱幾丁質(zhì)降解酶系基因家族分析第一章前言1.1幾丁質(zhì)與殼聚糖幾丁質(zhì)(Chitin)是一種由P-1,4-糖苷鍵連接7V-乙酸弄D-葡糖胺(GlcNAc)構(gòu)成的線性多聚糖。1811年法國植物學(xué)家Braconnot在蘑錯(cuò)中首次發(fā)現(xiàn)并分離得到。1823年法國科學(xué)家Odier發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)是生物外殼的組成成分之一，并命名為Chitin,源自希臘文信封一詞，也有外殼的意思(HudsonandJenkins2002)。幾丁質(zhì)在自然界中的含量豐富，僅次于纖維素，廣泛存在于真菌、線蟲、蓬類、節(jié)肢動(dòng)物及某些軟體動(dòng)物、腔腸動(dòng)物中。在自然界中的幾丁質(zhì)存在三種晶體
2、結(jié)構(gòu)，?-，yS-和7-幾丁質(zhì)。幾丁質(zhì)為生物體中的主要存在形式，也是最穩(wěn)定的形式，而后兩者在生物體中存在極少，僅在槍烏賊的內(nèi)部支撐羽狀結(jié)構(gòu)(骨路)、胃袋內(nèi)層及桂藻的棘狀突起中有報(bào)道(ChavanandDeshpande2013)。在大多數(shù)生物體中，幾丁質(zhì)與其他高分子聚合物(如葡聚糖、蛋白質(zhì)等)結(jié)合而形成各種結(jié)構(gòu)。而在一些環(huán)紋桂藻中，會產(chǎn)生由高度乙?；覜]有與其他聚合物結(jié)合的純幾丁質(zhì)形成的放射狀棘狀突起，是目前自然界中存在的純度最高的幾丁質(zhì)形式(Patiletal.2000)。在幾個(gè)真菌類群中幾丁質(zhì)能夠代替纖維素作為結(jié)抅多糖構(gòu)成其細(xì)胞壁結(jié)
3、構(gòu)。在昆蟲中，幾丁質(zhì)是構(gòu)成外骨體的重要成分，同時(shí)也存在于許多昆蟲的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中，如氣管內(nèi)壁、中腸圍食膜等組織，另外在一些昆蟲的唾液腺、口器、前腸、后腸及肌肉附著點(diǎn)也有幾丁質(zhì)的存在(KramerandMuthukrishnan2005)。幾丁質(zhì)與糖蛋白結(jié)合形成幾丁-蛋白復(fù)合體，形成堅(jiān)硬的外骨潘，維持昆蟲的特定形態(tài)，支撐昆蟲柔軟的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，保護(hù)昆蟲免受外界的機(jī)械損傷及病原侵染。由于表皮的堅(jiān)固性限制了昆蟲的生長，它會被周期性地降解以達(dá)到昆蟲生長發(fā)育的需求。昆蟲在不同發(fā)育階段其幾丁質(zhì)含量也隨之變化，Kramer等人報(bào)道在煙草天蛾(Mam/eret
4、al.1995)。在骨化前新蛹的表皮幾丁質(zhì)僅含有2%,而在骨化后含量劇增10倍多(KramerandMuthukrishnan2005)。.1.2幾丁質(zhì)代謝途徑在生物體中，幾丁質(zhì)在幾丁質(zhì)合成酶和降解酶的共同作用下維持動(dòng)態(tài)平衡。昆蟲幾丁質(zhì)的生物合成途後由血琳巴中含量較高的海蓬糖的分解開始用的酶是幾丁質(zhì)合成酶(MerzendorferandZimoch2003)(圖1-2)。第二章常用儀器、試剩與方法2.1常用儀器及主要試劑PCR儀，Bio-Red凝膠成像儀Gene-GeniusBio-Red實(shí)時(shí)熒光定量儀，Bio-Red顯微注射儀Femt
5、ojet，Eppendorf微量移液器，Eppendorf臺式冷凍離心機(jī)(Centrifoge5415R型)，Eppendorf超純水儀，MILIPORENanoDrop2000,ThermoScientific恒溫培養(yǎng)搖床，ThermoForma隔熱恒溫培養(yǎng)箱(9050型)，上海一恒科技有限公司-80°C冰箱，SANYO4°C,-20°C冰箱，Sumsung2.2常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法1)-8°C保存的菌種復(fù)蘇后均勻涂布于無抗性的LB平板上，37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10-12h;2)LB平板上挑取活化的單菌
6、落，接種于3mlLB液體培養(yǎng)基中，37°C恒溫?fù)u床200rpm培養(yǎng)過夜；3)取上述培養(yǎng)液1ml按照1:100的比例接入100mlLB液體培養(yǎng)基中，37°C200rpm搖菌2-3h，直至ODsoo值達(dá)到0.4-0.6之間；4)培養(yǎng)液置冰上冷卻l0min，分裝到無菌50ml離心管中并平衡，4°C，4000rpm離心5min,棄上清；5)每管加入26.7ml預(yù)冷的CaCl2(0.1M)，輕微震蕩混勻，懸浮細(xì)胞，冰上放置30min;6)4°C,4000rpm離心5min，棄上清；7)每管加入6.7ml預(yù)冷的CaC
7、l2(0.1M)，充分混句，冰上放置2h;8)每管加入80%甘油1.34ml作為冷凍保護(hù)刻(終濃度15-20%)，混勻后管進(jìn)行分裝，可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或-8°C超低溫冷凍保存?zhèn)溆?。第三章褐飛虱幾丁質(zhì)酶的基因分析及生物學(xué)功能..........153.1實(shí)驗(yàn)材料.........163.2實(shí)驗(yàn)方法.........173.3結(jié)果與分析.........223.4總結(jié)與討論.........41第四章褐飛虱y5-7V-乙酰己糖胺酶的基因分析及生物學(xué)功能.........434.1實(shí)驗(yàn)材料.........434.2實(shí)驗(yàn)方法.....
8、....444.3結(jié)果與分析.........474.4總結(jié)與討論.........57第五章褐飛虱幾丁質(zhì)脫乙酰酶的基因分析及生物學(xué)功能.........595.1實(shí)驗(yàn)材料.........605.2實(shí)驗(yàn)方
