細胞因子對hsct6細胞dcnmrna表達的影響

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1、細胞因子對HSCT6細胞DCNmRNA表達的影響【摘要】目的:探討細胞因子對核心蛋白聚糖（D）mRNA表達的調(diào)節(jié)作用。方法:以HSCT6細胞為研究靶細胞,選擇血小板衍生生長因子（PDGF）、IFN、TNFα和IL6,通過RTPCR技術觀察這些細胞因子對HSCT6細胞DmRNA表達的影響。結(jié)果:IFNγ在108～109U/L濃度能抑制HSCT6細胞增殖和增加DmRNA的表達,而IFNγ在105～106U/L濃度時使細胞DmRNA的表達降低;TNFα在高濃度（50nmol/L）能夠使DmRNA表達減少;PDGF在10μg/L和100mL/LF

2、CS培養(yǎng)條件下作用最明顯;IL6使HSCT6細胞DmRNA水平下調(diào)。結(jié)論:IFNγ和TNFα對D核心蛋白基因表達有雙重調(diào)節(jié)作用,這種調(diào)節(jié)作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平,PDGF對細胞增殖的調(diào)節(jié)與D表達抑制相關?！娟P鍵詞】核心蛋白聚糖（D）TNFαIFNγPDGFIL6眾所周知核心蛋白聚糖（decorin,D）具有抗組織纖維化作用,而細胞因子在對抗纖維化的形成機制中表現(xiàn)出重要而復雜的作用［1,2］,細胞因子是否能通過調(diào)節(jié)D的表達實現(xiàn)對抗肝纖維化的作用？其調(diào)節(jié)作用如何,國內(nèi)尚未見報道。我們通過RTPCR技術觀察IFNγ、TNFα、血小板衍生生長因

3、子（PDGF）和IL6對HSCT6細胞DmRNA表達的影響,旨在從免疫學角度探索肝纖維化治療的新途徑。　　1材料和方法　　1.1材料　　大鼠肝星形細胞株HSCT6細胞為MountSinai醫(yī)學院Friedman教授惠贈。RPMI1640培養(yǎng)基購自GibcoBRL公司。rhTNFα、rhIFNγ和rhPDGFBB購自美國RD公司。RNA抽提試劑盒購自德國QIAGEN公司。PCR擴增儀購自TECHNE公司。紫外凝膠成像分析系統(tǒng)型號VL為法國VILBER公司產(chǎn)品。　　1.2方法　　1.2.1細胞培養(yǎng)　　HSCT6細胞50mL/LCO2、37℃孵箱中培

4、養(yǎng),RPMI1640含100mL/L熱滅活新生牛血清。細胞密度為0.1×106～1×106,每2～3d傳代1次,取對數(shù)生長期細胞用于實驗?！　?.2.2細胞處理　　取對數(shù)生長期細胞,調(diào)整細胞密度為1×108/L,接種于50mL培養(yǎng)瓶,5mL/瓶。18～20h換含10mL/LFCSRPMI1640培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)20～24h使細胞靜止;分組換液,換含100mL/LFCSRPMI1640培養(yǎng)液,同時加入不同種類、不同濃度的細胞因子,對照組只加培養(yǎng)基不加細胞因子。培養(yǎng)24h后收集細胞并抽提總RNA。　　1.2.3總RNA抽提　　用德國QIAGEN公司試劑盒抽提,按

5、說明進行操作。將細胞先用冷PBS洗滌、胰蛋白酶消化、收集,然后抽提總RNA。對所得樣品RNA經(jīng)紫外分光光度儀進行濃度及純度測定,-70℃保存?！　?.2.4RTPCR擴增　　2μg總RNA加入25μL反轉(zhuǎn)錄體系中,42℃1h,94℃3min終止反應。取2.5μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入PCR反應體系中,在PCR儀中進行反應。擴增反應參數(shù)如下:94℃30s,60℃30s,72℃50s,35個循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物保存于-20℃?！　?.2.5結(jié)果觀察和分析　　電泳觀察特異性條帶并進行PCR相對半定量分析。取RTPCR產(chǎn)物10μL上樣于15g/L瓊脂糖凝膠（含EB）,7

6、0V電泳30min,用法國VILBER凝膠成像儀對特異性電泳條帶進行觀察和分析。各樣本用同一標本的βactin密度值校正?！　?結(jié)果　　2.1不同血清濃度時DmRNA的轉(zhuǎn)錄　　在低血清濃度條件下DmRNA轉(zhuǎn)錄表達量高于在高血清濃度條件下的轉(zhuǎn)錄,以2mL/LFCS轉(zhuǎn)錄較高（圖1）?！　?.2PDGF在不同血清濃度中對DmRNA表達的影響　　PDGF在100mL/LFCS條件下與HSCT6細胞作用24h,DmRNA表達明顯被抑制,低濃度血清中無明顯影響（圖1）?！　　　?討論與肝纖維化發(fā)生有關的細胞因子主要是一類由炎癥或纖維化部位的有關細胞合成和分泌的,作用

7、于靶細胞特定受體發(fā)揮局部生物學效應的因子。國內(nèi)外資料和本室前期的研究發(fā)現(xiàn),肝纖維化時PDGF等水平及其受體均有不同程度的改變。　　IFN可從轉(zhuǎn)錄水平抑制成纖維細胞合成膠原,對抗組織纖維化［3,4］。本研究中我們發(fā)現(xiàn),IFNγ在108～109U/L濃度能抑制HSCT6細胞增殖和增加DmRNA的表達,提示IFNγ對DmRNA表達有調(diào)節(jié)作用,而且促進D表達與其抑制HSC增殖相關;IFNγ在105～106U/L濃度時使細胞DmRNA的表達降低,細胞增殖也有增加的趨勢。IFNγ對D表達的調(diào)節(jié)可能是對細胞增殖的調(diào)節(jié)機制之一。TNFα對肝纖維化的影響具有雙重性

8、：既能促進細胞增殖,又能抑制間質(zhì)細胞膠原的合成。TN