阿霉素誘導(dǎo)鼻咽癌細胞凋亡的作用機制

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1、阿霉素誘導(dǎo)鼻咽癌細胞凋亡的作用機制　　阿霉素（adriamycin,ADM）為蒽環(huán)類抗生素，抗瘤譜較廣，療效高，是臨床常用的抗腫瘤藥物。除白血病外，其對膀胱癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌、軟組織肉瘤以及侵蝕性淋巴瘤等都有療效[1].阿霉素抗腫瘤作用機制包括誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制細胞周期以及使腫瘤細胞發(fā)生自噬等[2].文獻報道，阿霉素可能通過影響B(tài)cl-2/Bax[3]、JNK凋亡通路[3]、p53凋亡通路[4]以及激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）[5]等誘導(dǎo)細胞凋亡，但其確切機制仍未十分明了。細胞凋亡早期出現(xiàn)的細胞容積減小稱為凋亡性細胞皺縮（apoptotic

2、volumedecrease,AVD）,是具有普遍性意義的細胞凋亡早期的標志性事件。我們實驗室前期研究表明，氯通道參與過氧化氫誘導(dǎo)的腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞凋亡[6]、紫杉醇[7]和丹參酮[8]誘導(dǎo)的低分化鼻咽癌E-2Z細胞的凋亡。這些結(jié)果提示多種抗腫瘤藥物都可能通過激活氯通道引起AVD,繼而誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮其抗癌作用。　　本研究旨在探討阿霉素是否通過激活細胞氯通道而誘導(dǎo)凋亡性細胞皺縮，從離子通道的角度來探討阿霉素誘導(dǎo)E-2Z細胞凋亡的作用機制。　　1材料與方法　　1.1細胞培養(yǎng)用含10%小牛血清、雙抗（1105UL-1青霉素與100mgL-1鏈霉素）的RPMI1640生

3、長液，在37°C恒溫培養(yǎng)箱（5%CO2、飽和濕度）內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)低分化鼻咽癌細胞（E-2Z）,每兩天傳代1次。實驗前取對數(shù)生長期的E-2Z細胞，用0.25%胰酶進行消化傳代，收集、重懸細胞，將細胞懸液接種于直徑22mm的圓形玻片上，置入培養(yǎng)箱使細胞貼壁，待細胞貼壁1h后進行實驗?！　?.2主要試劑與藥品鹽酸阿霉素固體粉末購于上海生工生物有限公司，用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成濃度為2.5mmolL-1的儲存液，儲存在4℃冰箱中，使用前稀釋至終濃度。氯通道阻斷劑5-nitro-2-（3-phenylpropylamino）-benzoate（NPPB）購自Sigma公司，溶于d

4、imethylsulfoxide（DMSO）中，配成100mmolL-1的儲存液，工作濃度為100μmolL-1.等滲灌流液組成（mmolL-1）:10HEPES,0.5MgCl2,70NaCl,140D-mannitol,2CaCl2,用冰點滲透壓計（Osmomat030,Gono2tec）調(diào)節(jié)溶液滲透壓至300mOsmolL-1,用Tris-base調(diào)節(jié)pH至7.4.1.3細胞容積測量將貼有細胞的玻片置于灌流槽內(nèi)，在倒置相差顯微鏡（IX71,Olympus,日本）下選擇固定視野，用圖像分析軟件（Image-ProPlus6.3,MediaCyberics,USA）控制數(shù)字式攝

5、像機（RETIGA4000R,QImaging,Canada）,進行連續(xù)拍攝，每2min拍攝一幅，直至2h.拍攝的圖片用ScionImage圖像分析軟件（ScionCorporation）處理，測量細胞直徑與面積，用以下公式計算細胞容積（V）:V=4/3（直徑/2）3,并標準化細胞容積（Vst）:Vst=（Vt/Vo）100%（Vt:細胞的實際容積，Vo:藥物刺激前即等滲條件下（對照）的細胞平均容積）.實驗分為空白對照組（Iso）、阿霉素組（ADM,2.5μmolL-1）、氯通道阻斷劑NPPB組（100μmolL-1）、阿霉素（2.5μmolL-1）+NPPB（100

6、μmolL-1）組。實驗環(huán)境溫度為室溫（20℃~24℃）.　　1.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡細胞種植于6孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h,按上述實驗分組進行處理。36h后，收集細胞，用PBS沖洗，并用預(yù)冷的70%乙醇于-20℃固定30min.PBS清洗并離心，加入propidiumiodide（PI,50mgL-1）,室溫避光染色15min.用流式細胞儀（CoulterEPTCSXL-31240,Coulter,USA）進行分析。　　1.5膜片鉗全細胞記錄技術(shù)EPC-7膜片鉗放大器（ListElectronic,Germany）用于記錄全細胞電流，CED1401（Cambridge,UK

7、）用于數(shù)字化（采樣頻率3kHz）電流和電壓信號。拉制的電極是硼硅酸鹽毛細玻璃管，其內(nèi)徑為0.86mm,外直徑為1.5mm,內(nèi)含細長絲，于垂直微電極拉制器（PB-7）上，分兩步拉制。將電極內(nèi)液充灌至電極容積的1/3至2/3間，此時阻抗約為（5-10）MΩ。全細胞記錄模式構(gòu)建完成后，開始記錄實驗數(shù)據(jù)。將細胞鉗制在氯離子的平衡電位（0mV）.按指令電壓的順序（±40,0和±80mV）循環(huán)記錄氯電流變化。每一電位