第二章 欖仁葉主要成分測定

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1、第二章欖仁葉主要成分測定2.1實(shí)驗(yàn)儀器與試劑2.1.1粗蛋白測定，采用考馬斯亮藍(lán)法一、儀器（1）分析天平（2）具塞刻度試管10ml×8（3）吸管0.lml×I，lml×Z，5ml×I（4）研缽（5）漏斗（6）離心管10ml（7）容量瓶10ml（8）離心機(jī)（9）721型分光光度計(jì)二、試劑（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液稱取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水并定容至100ml，制成100pg／ml的原液。（2）考馬斯亮藍(lán)G－250蛋白試劑稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G－250，溶于50ml90％乙醇中，加入85％（m／v）的磷酸100ml，最后用蒸餾水定容

2、到1000ml。2.1.2粗脂肪的測定，采用索氏抽提法1、索氏提取器2、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。3、干燥器。4、恒溫水浴箱。5、濾紙筒。6、無水乙醚（不含過氧化物）或石油醚（沸程30℃～60℃）2.1.3粗纖維的測定，采用重量法測定一、儀器1、實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī)或研缽。2、分樣篩:孔徑0.45mm(40目)。3、分析天平:感量0.0001g。4、電熱恒溫箱:可控制溫度在130℃。5、高溫爐:電加熱,有高溫計(jì)且可控制爐溫在550-600℃。6、消煮器:有冷凝球的高型燒杯(500ml)或有冷凝管的錐形瓶。7、過濾裝置:抽真空裝置、吸濾瓶及漏斗

3、。8、濾器:200目不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng),或G2號(hào)玻璃濾器。9、古氏坩鍋:30ml,預(yù)先加入30ml酸洗石棉懸浮液,再抽干,以石棉厚度均勻、不透光為宜。10、干燥器,以氯化鈣(干燥試劑)或變色硅膠為干燥劑。二、試劑1、硫酸(GB625-77):分析純,0.255±0.005N,每100ml含硫酸1.25g,應(yīng)用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定。2、氫氧化鈉(GB629-81):分析純,0.313±0.005N,每100ml含氫氧化鈉1.25g,應(yīng)用鄰苯二甲酸氫鉀法標(biāo)定,不含或微含碳酸鈉。3、酸洗石棉:市售或自制(中等長度酸洗石棉在1:3的鹽酸

4、中煮沸45min,過濾后于550℃灼燒16h,用0.255N硫酸浸泡且煮沸30min,過濾且用水洗凈酸,同樣用0.313N氫氧化鈉溶液煮沸30min,過濾,用少量硫酸溶液洗一次,再用水洗凈,烘干后于550℃灼燒2h,其空白試驗(yàn)結(jié)果為每克石棉含粗纖維值小于1mg。4、95%乙醇(GB679-80):化學(xué)純。5、乙醚(HG3-1002-79):化學(xué)純。6、正辛醇：分析純，防泡劑。2.1.4粗灰分的測定，直接灰化法測定一、儀器15-25ml的石英坩堝高溫電爐干燥器分析天平水浴鍋或調(diào)溫鼓風(fēng)烘箱二、試劑硝酸1:1溶液30%的雙氧水100g

5、/L硝酸銨溶液：稱硝酸銨10.0g溶于100ml水中、2.2實(shí)驗(yàn)步驟2.2.1粗蛋白測定，采用考馬斯亮藍(lán)法1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支具塞試管，編號(hào)后，按下表加入試劑。操作項(xiàng)目管號(hào)123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(ml)00.20.40.60.81.0蒸餾水(ml)1.00.80.60.40.20G-250試劑(ml)各5蛋白質(zhì)含量（μg）020406080100蓋上塞子，搖勻。放置2min后在595nm波長下比色測定（比色應(yīng)在lh內(nèi)完成）。以牛血清白蛋白含量（μg）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2．樣品中蛋白質(zhì)含量的測定（1）稱取

6、1g的欖仁樹葉，取葉片加5倍體積PH8.0的100mmol/L磷酸緩沖液于研缽中將葉片研磨至漿狀。四層紗布過濾。將濾液在4度下離心3分鐘，取上清液即得葉片粗蛋白。（2）另取1支具塞試管，準(zhǔn)確加入0.lml樣品提取液，再加入0.9ml蒸餾水，5ml考馬斯亮藍(lán)G－250試劑，充分混合，放置2min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線1號(hào)試管做參比，在595nm波長下比色，記錄吸光度。3.結(jié)果處理根據(jù)所測樣品提取液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量（μg），按下式計(jì)算：樣品蛋白質(zhì)含量（μg／g鮮重）＝（查得的蛋白質(zhì)含量（μg）×提取液總體積（ml））／（

7、樣品鮮重（g）×測定時(shí)取用提取液的體積（ml））4.注意事項(xiàng)（1）如果測定要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入后的5-20min內(nèi)測定光吸收，因?yàn)檫@段時(shí)間內(nèi)顏色最穩(wěn)定。（2）測定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，但此復(fù)合物的吸附量可以忽略。測定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。2.2.2粗脂肪的測定，采用索氏抽提法