磷酸肌酸對大鼠心肌缺血再灌注后bcl-2和bax蛋白表達的影響

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1、磷酸肌酸對大鼠心肌缺血再灌注后Bcl-2和Bax蛋白表達的影響中國實驗診斷學2011年4月第l5卷第4期文章編號:1007—4287(2011)o4—0617～02磷酸肌酸對大鼠心肌缺血再灌注后Bc1.2和Bax蛋白表達的影響周麗防一,劉津,康治臣(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院心內(nèi)科,吉林長春130033;2.長春市中心醫(yī)院心內(nèi)科;3,海洋石油總醫(yī)院;4.吉林大學第二醫(yī)院)細胞凋亡在多種疾病的發(fā)生,發(fā)展過程中有重要的意義.Bcl一2被認為是細胞凋亡調(diào)控的最后通路之一,在細胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用,而Bax作

2、為Bc1.2的同源體,與Bcl一2一樣在組織中廣泛表達,作用是抑制Bcl一2表達及活性.有研究表明,Bax與Bcl.2在細胞中的比例決定細胞是否發(fā)生凋亡.Bax過量時,形成Bax--Bax同二聚體,誘導細胞凋亡;Bcl一2過量時,形成Bcl一2Bax異二聚體,抑制細胞凋亡I;磷酸肌酸是一種極易被心肌細胞使用的能量形式E3j,磷酸肌酸基本藥理作用為增加冠脈血流及血管灌注量,延長動物耐缺氧時間,保護缺血心肌等.本實驗通過建立大鼠心肌缺血再灌注的模型,觀察磷酸肌酸對體外大鼠心肌Bcl一2,Bax的改變,.以闡述其心

3、肌保護作用機制,為磷酸肌酸的臨床應用提供實驗依據(jù).1材料與方法1.1實驗動物及所用試劑健康成年雄性SD大鼠30只,體重200—250g,由吉林大學實驗動物中心提供.磷酸肌酸由?？谄媪χ扑幑煞萦邢薰旧a(chǎn),Bcl一2,Bax免疫組化試劑盒購于武漢博士德公司.1.2實驗動物和分組30只健康sD大鼠,體質(zhì)量200～250g,隨機分為正常對照組,缺血再灌注組,磷酸肌酸組,每組l0只,假手術(shù)組:僅麻痹后胸取左心室肌作為缺血前對照.缺血再灌注組:取心臟,建離體灌注模型;Krebs—Henseleit緩沖液預灌注15min

4、,待心臟穩(wěn)定搏動后,給予常規(guī)含鉀停搏液灌注,37.5~C停灌30rain,復灌60rain;磷酸肌酸組:收心臟,建立離體灌注模型,待心臟穩(wěn)定搏動后,給予常規(guī)含鉀停搏液加磷酸肌酸(3mg/kg)灌注,37.50C停灌30FdiI1,復灌60min.1.3動物模型制備將動物隨機分為假手術(shù)組,模型組,磷酸治療組,每組10只.用20%烏拉坦0.8g/充分麻醉大鼠后迅速置大鼠于動物臺上并固定.剪開腹部皮膚,沿腹白線開腹,至劍突.提出腸道置于一側(cè),暴露下腔靜脈,按3mg/kg經(jīng)下腔靜脈一617一注射肝素生理鹽水.1min

5、后充分肝素化,剪開腹腔血管放血.迅速開胸,剪去胸腺組織,充分暴露心臟及大血管.游離主動脈至無名動脈遠端,并剪斷,迅速將其余大血管一并結(jié)扎并剪斷,取出心臟,置于4~CK—H液中簡單修剪.開啟離體心臟灌注系統(tǒng),灌注37%,95%O2,+5%CO2混合氣持續(xù)氧合的K—H緩沖液,流量約15ml/min.器械提起主動脈,將灌注管道捅人,置于主動脈瓣及冠狀動脈開口上方,打結(jié)固定,開始灌注,心臟迅速恢復搏動.在肺動脈網(wǎng)錐處剪一小口,使冠狀動脈流出液自然流出.剪開左心耳,將左心室測壓管經(jīng)切口,左心房,二尖瓣插入,并將另一連于

6、灌輸瓶的灌注管插入左心房,打結(jié)固定.連接各測管道并調(diào)零,開始i貝0量.調(diào)整離體心臟灌注系統(tǒng)轉(zhuǎn)速及流量,使主動脈根部壓力約80CIIiH2O而灌注瓶與左心房落差約20emH'O,相當于左心室前負荷為20em}{2O,后負荷為80cmH2O臟持續(xù)穩(wěn)定搏動.待心臟穩(wěn)定搏動15min后,采用心臟停搏液從主動脈根部緩慢灌注(2min,壓力7.98kPa)使心臟停搏,停搏后用冰鹽水紗布包裹心臟,維持低溫狀態(tài),停搏30min后復溫,復灌37%,95%O2+5%C0,混合氣持續(xù)氧合的K—H緩沖液,復跳,工作60min后停止實

7、驗關(guān)閉灌注系統(tǒng),取下心臟迅速液氮罐中冷卻,然后放人3℃一7℃的冰箱中冷藏.心臟的人選標準是心臟灌流平衡30min后,符合心率>180次/min,冠狀動脈流量5—10ml/min的心臟人選,缺血或再灌注期問若出現(xiàn)持續(xù)心室顫動>5rain的剔除.1.4IFUNEL法檢測心肌細胞凋亡缺血區(qū)心肌4O0mg,放在40g/L中性甲醛中固定24h,逐級乙醇脫水,石蠟包埋切片按FUNEI試劑盒說明書進行標記染色,凋亡的細胞核被染成棕黃色,未凋亡的細胞核為深藍色.高倍鏡下每張切片隨機選取1O個視野,計數(shù)凋亡陽性細胞

8、,以凋亡指數(shù)反映各組心肌凋亡的情況,凋亡指數(shù)=視野內(nèi)凋亡細胞個數(shù)/視野內(nèi)所有心肌細胞個數(shù)×100%.一618—1.5免疫組織化學檢測Bc1.2和Bax蛋白的表達應用與上述TUNEI法相同的組織蠟塊切片行Bcl一2和Bax免疫組織化學檢測.一抗:1:100磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋的Bc1.2,Bax抗體.具體步驟按SABC試劑盒說明書操作,DAB顯色,中性樹脂封片.用PBS代替一抗作為陰對照.陽性表