資源描述：
《修飾htert核心啟動子靶向轉(zhuǎn)錄fcy1的重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、修飾hTERT核心啟動子靶向轉(zhuǎn)錄FCY1的重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定：滑瑋，辛?xí)匝?，蘇明權(quán)，李立文【關(guān)鍵詞】末端轉(zhuǎn)移酶 【Abstract】AIM：Toconstructandidentifytranscriptionaltargetingreplication-defectiverebinantadenovirusescontainingFCY1drivenbyhTERTcorepromotermodifiedbyestrogenresponseelementsandhypoxiaresponsiveelements.METHODS:ThehTERTcorepromotermodifiedby
2、tandemsequencesofestrogenresponseelementsandhypoxiaresponsiveelementsotersequenceandtheFCY1genefragmentid,thentheshuttleplasmidandrescueplasmidplification,therebinantadenoviraltiterinedbyendpointdilutionassay.RESULTS:ThesequenceofthemodifiedhTERTcorepromoterplifiedthe122bptargetedfragment.Therebinan
3、tadenoviraltiterdeterminedbyendpointdilutionassayL-1.CONCLUSION:ReplicationdefectiverebinantadenovirusescontainingFCY1drivenbyhTERTcorepromotermodifiedbytandemsequencesofestrogenresponseelementsandhypoxiaresponsiveelementsaresuccessfullyconstructedandrebinantvirusesofhightiterhavebeenobtained. 【Key
4、erasepromoter；regions(geus)；estrogenresponseelement；hypoxiareponsiveelement；transcriptionaltargeting；ovarianneoplasms 【摘要】目的：構(gòu)建并鑒定雌激素反應(yīng)元件與缺氧反應(yīng)元件共修飾人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）核心啟動子靶向轉(zhuǎn)錄酵母胞嘧啶脫氨酶（FCY1）的復(fù)制缺陷型重組腺病毒.方法：構(gòu)建由雌激素反應(yīng)元件（ERE）和缺氧反應(yīng)元件（HRE）串聯(lián)重復(fù)序列共修飾的hTERT核心啟動子，將該啟動子序列與酵母胞嘧啶脫氨酶(FCY1)基因插入穿梭質(zhì)粒，用穿梭質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)
5、胞，獲得重組腺病毒載體AdEHhTFCY1，經(jīng)PCR鑒定證實后，采用終點稀釋試驗測定病毒滴度.結(jié)果：經(jīng)24HRE與8ERE共修飾的hTERT核心啟動子序列經(jīng)正反向測序均正確；穿梭質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后7~10d出現(xiàn)了典型的細(xì)胞病變反應(yīng)（CPE），PCR反應(yīng)能擴增出122bp的目的片段，終點稀釋試驗測定得到的病毒滴度為62×107pfu・mL-1.結(jié)論：成功構(gòu)建并獲得高滴度的ERE與HRE串聯(lián)重復(fù)序列共修飾的hTERT核心啟動子引導(dǎo)FCY1轉(zhuǎn)錄的復(fù)制缺陷型重組腺病毒. 【關(guān)鍵詞】端粒，末端轉(zhuǎn)移酶；啟動區(qū)（遺傳學(xué)）；雌激素反應(yīng)元件；缺氧反應(yīng)元件；靶向轉(zhuǎn)錄；
6、卵巢腫瘤 0引言 在惡性腫瘤的基因治療中，酶解前體藥物策略已得到廣泛的應(yīng)用［1，2］.然而，由于缺乏對腫瘤細(xì)胞的選擇性，使其在臨床實踐中的進(jìn)一步應(yīng)用受到限制.如何把前體藥物轉(zhuǎn)換酶基因的表達(dá)嚴(yán)格限制在腫瘤細(xì)胞中，是提高該策略治療指數(shù)的關(guān)鍵.近年來，轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為腫瘤基因治療的研究熱點［3］，即根據(jù)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞分子間的差異，在轉(zhuǎn)錄水平上對治療基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控.人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）啟動子已被用作靶向轉(zhuǎn)錄啟動子對多種腫瘤進(jìn)行了基因治療的實驗研究［4,5］.我們構(gòu)建了hTERT核心啟動子引導(dǎo)酵母源性胞嘧啶脫氨酶基因（FCY1）表達(dá)的重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體，使目的基因的表達(dá)限制在腫瘤
7、細(xì)胞中.另據(jù)報道，雌激素可通過與雌激素受體的結(jié)合及與雌激素反應(yīng)元件（ERE）的相互作用，激活hTERT的表達(dá)［6］；而采用缺氧反應(yīng)元件（HRE）修飾啟動子可使目的基因在瘤體內(nèi)的表達(dá)相對特異［7］.我們根據(jù)卵巢癌的內(nèi)分泌特點及瘤體內(nèi)缺氧的特征，構(gòu)建ERE和HRE的串聯(lián)重復(fù)序列，作為順式作用元件，進(jìn)一步提高h(yuǎn)TERT啟動子在卵巢癌細(xì)胞中的活性，進(jìn)而使治療基因在卵巢癌組織中高效特異的表達(dá). 1材料和方
