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《實驗26吲哚乙酸含量與吲哚乙酸氧化酶活性的測定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、實驗26吲哚乙酸含量與吲哚乙酸氧化酶活性的測定?植物體內(nèi)生長素的種類很多，其中吲哚乙酸（1AA）是植物體內(nèi)普遍存在的一種生長素。于不同的生育期測定不同器官中IAA的含量以及IAA氧化酶的活性，對于研究植物的生長、發(fā)育、衰老、脫落等均有重要意義。Ⅰ吲哚乙酸含量的測定一、原理1947年，我國植物生理學(xué)家湯玉瑋等發(fā)現(xiàn)，在無機酸存在下，吲哚乙酸能與FeCl3作用，生成紅色的鰲合物。該物質(zhì)在530nm有最大吸收峰，由此引出IAA的比色定量測定，此法可測出μg量級的IAA。二、實驗材料、試劑與儀器設(shè)備（一）
2、實驗材料玉米種子。（二）試劑1.IAA標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取IAA（A.R.）10mg，先用少量乙醇溶解，后用蒸餾水定容至100mL（其濃度為100μg/mL）作為貯備液；然后用貯備液配成0（空白）、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg/mL的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為工作液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。2.試劑A：內(nèi)含0.5mol/LFeCl3溶液15mL、濃H2SO4（比重1.84）300mL、蒸餾水500mL，于使用前混合搖勻，避光保存，lmL試液需加此試劑4mL。3.試劑B：內(nèi)含0
3、.5mol/LFeCl3溶液10mL、35％高氯酸500mL，于使用前混合搖勻，避光保存，lmL試液應(yīng)加此試劑2mL。試劑A與試劑B可任選一種（試劑B比試劑A靈敏）。4.0.1mol/LNaOH溶液。5.甲醇。（三）儀器設(shè)備分光光度計，離心機，粉碎機，天平，水浴鍋，移液管，大試管，燒杯。三、實驗步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取干潔大試管8支（0～7號），依次加入IAA系列濃度工作液2mL，分別加入試劑B4mL（或試劑A8mL），于40℃溫箱中暗保溫30min（加速顯色反應(yīng)）；于530nm下比色，以O(shè)D值為
4、縱坐標(biāo)，以IAA濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.生長素的提取與測定將風(fēng)干的玉米種子（最好是白玉米）用粉碎機磨成細(xì)粉（約lmm大小的細(xì)粒，太粗提取不完全，太細(xì)加熱時易糊化而使離心困難）；稱取粉末10g裝入燒杯，加入0.1mol/LNaOH溶液40mL，于100℃水浴中煮沸15min（上面加蓋防止水分蒸干）；取出燒杯后再向其內(nèi)加入0.1mol/LNaOH溶液25mL，充分搖勻，用甲醇定容至100mL，靜置30min，取上層液離心30min，上清液即為IAA提取液。取干潔大試管2支，
5、依次各加入上述樣品IAA提取液2mL和試劑B4mL（或試劑A8mL），于40℃溫箱中顯色30min，在530nm下比色（以標(biāo)準(zhǔn)曲線的“0”調(diào)零），記錄OD值。四、結(jié)果計算式中：A——標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的IAA量，μg。Vl——樣品提取液體積，mL。W——樣品重量，g。V2——樣品反應(yīng)液體積，mL。?Ⅱ吲哚乙酸氧化酶活性的測定一、原理吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶作用下，被分解成不活躍的物質(zhì)。植物體內(nèi)吲哚乙酸氧化酶活力的大小，對調(diào)節(jié)體內(nèi)吲哚乙酸的水平起著重要的作用。酶活力的大小可用其破壞吲哚乙酸的速度表示，
6、吲哚乙酸的含量可用比色法測定。二、實驗材料、試劑與儀器設(shè)備（一）實驗材料大豆或綠豆幼苗的下胚軸。（二）試劑1．0.02mol/L磷酸緩沖液（pH6.1）。2．1mmol/LMnCl2：稱取MnCl2·4H2O19.8mg用蒸餾水定容至100mL。3．1mmol/L2,4–二氯酚：稱取二氯酚16.3mg用蒸餾水定容至100mL。4．200μg/mLIAA。5．試劑A：內(nèi)含0.5mol/LFeCl3溶液15mL、濃H2SO4（比重1.84）300mL、蒸餾水500mL，于使用前混合搖勻，避光保存，l
7、mL試液需加此試劑4mL。6．試劑B：內(nèi)含0.5mol/LFeCl3溶液10mL、35％高氯酸500mL，于使用前混合搖勻，避光保存，lmL試液應(yīng)加此試劑2mL。試劑A與試劑B可任選一種（試劑B比試劑A靈敏）。（三）儀器設(shè)備分光光度計，離心機，研缽，移液管（5mL2支，2mL2支，1mL4支），燒杯1個，恒溫水浴，天平，試管12支。三、實驗步驟1.吲哚乙酸氧化酶的制備（1）將大豆或綠豆種子于30℃溫箱中萌發(fā)3～4天，選取生長一致的幼苗，除去子葉，留下胚軸作實驗材料。（2）取20株下胚軸，稱得重量
8、，置于研缽中加入冰冷的磷酸緩沖液（pH6.1）5mL及石英砂少許，于冰浴中研磨成勻漿，再按100mg鮮重加1mL緩沖液的比例稀釋之，離心（4000rpm）20min，所得上清液即為酶液。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（1）配制吲哚乙酸的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度分別為0、0.5、1.0、2.5、5、10、15、20、25μg/mL。（2）取干潔的大試管9支，每支加入試劑B4mL，再分別加入不同濃度的IAA溶液各2mL，搖勻，于40℃的溫箱中保溫30min，使反應(yīng)呈紅色。（3）取反應(yīng)液用分光光度計進行測定，測定時用
