提高顯微鏡的方法

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1、【摘要】提高光學(xué)顯微鏡分辨率的研究主要集中在兩個(gè)方面進(jìn)行，一是利用經(jīng)典方法提高各種條件下的空間分辨率，如用于厚樣品研究的SPIM技術(shù)，用于快速測量的SHG技術(shù)以及用于活細(xì)胞研究的MPM技術(shù)等。二是將最新的非線性技術(shù)與高數(shù)值孔徑測量技術(shù)（如STED和SSIM技術(shù)）相結(jié)合。生物科學(xué)研究離不開超高分辨率顯微術(shù)的技術(shù)支撐，人們迫切需要更新顯微術(shù)來適應(yīng)時(shí)代發(fā)展的要求。近年來研究表明，光學(xué)顯微鏡的分辨率已經(jīng)成功突破200nm橫向分辨率和400nm軸向分辨率的衍射極限。高分辨率乃至超高分辨率光學(xué)顯微術(shù)的發(fā)展不僅在于技術(shù)本身的進(jìn)步，而且它將會極大促進(jìn)生物樣品的研究，為亞細(xì)胞級和分子水平的研究提供新的手段?！?/p>

2、關(guān)鍵詞】光學(xué)顯微鏡；高分辨率；非線性技術(shù)；納米水平　在生物學(xué)發(fā)展的歷程中顯微鏡技術(shù)的作用至關(guān)重要，尤其是早期顯微術(shù)領(lǐng)域的某些重要發(fā)現(xiàn)，直接促成了細(xì)胞生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的突破性發(fā)展。對固定樣品和活體樣品的生物結(jié)構(gòu)和過程的觀察，使得光學(xué)顯微鏡成為絕大多數(shù)生命科學(xué)研究的必備儀器。隨著生命科學(xué)的研究由整個(gè)物種發(fā)展到分子水平，顯微鏡的空間分辨率及鑒別精微細(xì)節(jié)的能力已經(jīng)成為一個(gè)非常關(guān)鍵的技術(shù)問題。光學(xué)顯微鏡的發(fā)展史就是人類不斷挑戰(zhàn)分辨率極限的歷史。在400～760nm的可見光范圍內(nèi)，顯微鏡的分辨極限大約是光波的半個(gè)波長，約為200nm，而最新取得的研究成果所能達(dá)到的極限值為20～30nm。本文主要從高分

3、辨率三維顯微術(shù)和高分辨率表面顯微術(shù)兩個(gè)方面，綜述高分辨率光學(xué)顯微鏡的各種技術(shù)原理以及近年來在突破光的衍射極限方面所取得的研究進(jìn)展?！　?傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率　　光學(xué)顯微鏡圖像的大小主要取決于光線的波長和顯微鏡物鏡的有限尺寸。類似點(diǎn)源的物體在像空間的亮度分布稱為光學(xué)系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(pointspreadfunction,PSF)。因?yàn)楣鈱W(xué)系統(tǒng)的特點(diǎn)和發(fā)射光的性質(zhì)決定了光學(xué)顯微鏡不是真正意義上的線性移不變系統(tǒng)，所以PSF通常在垂直于光軸的x-y平面上呈徑向?qū)ΨQ分布，但沿z光軸方向具有明顯的擴(kuò)展。由Rayleigh判據(jù)可知，兩點(diǎn)間能夠分辨的最小間距大約等于PSF的寬度?！　「鶕?jù)Rayleigh

4、判據(jù)，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率極限由以下公式表示[1]：　　橫向分辨率(x-y平面)：dx，y=■　　軸向分辨率(沿z光軸)：dz=■　　可見，光學(xué)顯微鏡分辨率的提高受到光波波長λ和顯微鏡的數(shù)值孔徑N.A等因素的制約；PSF越窄，光學(xué)成像系統(tǒng)的分辨率就越高。為提高分辨率，可通過以下兩個(gè)途徑：（1）選擇更短的波長；（2）為提高數(shù)值孔徑,用折射率很高的材料?！　ayleigh判據(jù)是建立在傳播波的假設(shè)上的，若能夠探測非輻射場，就有可能突破Rayleigh判據(jù)關(guān)于衍射壁壘的限制?！　?高分辨率三維顯微術(shù)　　在提高光學(xué)顯微鏡分辨率的研究中，顯微鏡物鏡的像差和色差校正具有非常重要的意義。從一般的透鏡組合

5、方式到利用光闌限制非近軸光線，從穩(wěn)定消色差到復(fù)消色差再到超消色差，都明顯提高了光學(xué)顯微鏡的成像質(zhì)量。最近Kam等[2]和Booth等[3]應(yīng)用自適應(yīng)光學(xué)原理，在顯微鏡像差校正方面進(jìn)行了相關(guān)研究。自適應(yīng)光學(xué)系統(tǒng)由波前傳感器、可變形透鏡、計(jì)算機(jī)、控制硬件和特定的軟件組成，用于連續(xù)測量顯微鏡系統(tǒng)的像差并進(jìn)行自動(dòng)校正?！∫话憧蓪F(xiàn)有的高分辨率三維顯微術(shù)分為3類：共聚焦與去卷積顯微術(shù)、干涉成像顯微術(shù)和非線性顯微術(shù)?！　?.1共聚焦顯微術(shù)與去卷積顯微術(shù)解決厚的生物樣品顯微成像較為成熟的方法是使用共聚焦顯微術(shù)(confocalmicroscopy)[4]和三維去卷積顯微術(shù)(three-dimensiona

6、ldeconvolutionmicroscopy,3-DDM)[5]，它們都能在無需制備樣品物理切片的前提下，僅利用光學(xué)切片就獲得樣品的三維熒光顯微圖像。　　共聚焦顯微術(shù)的主要特點(diǎn)是，通過應(yīng)用探測針孔去除非共焦平面熒光目標(biāo)產(chǎn)生的熒光來改善圖像反差。共聚焦顯微鏡的PSF與常規(guī)顯微鏡的PSF呈平方關(guān)系，分辨率的改善約為■倍。為獲得滿意的圖像，三維共聚焦技術(shù)常需使用高強(qiáng)度的激發(fā)光，從而導(dǎo)致染料漂白，對活生物樣品產(chǎn)生光毒性。加之結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價(jià)格昂貴，從而使應(yīng)用在一定程度上受到了限制?！　?-DDM采用軟件方式處理整個(gè)光學(xué)切片序列，與共聚焦顯微鏡相比，該技術(shù)采用低強(qiáng)度激發(fā)光，減少了光漂白和光毒性，適合對

7、活生物樣品進(jìn)行較長時(shí)間的研究。利用科學(xué)級冷卻型CCD傳感器同時(shí)探測焦平面與鄰近離焦平面的光子，具有寬的動(dòng)態(tài)范圍和較長的可曝光時(shí)間，提高了光學(xué)效率和圖像信噪比。3-DDM拓展了傳統(tǒng)寬場熒光顯微鏡的應(yīng)用領(lǐng)域受到生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[6]?！　?.2選擇性平面照明顯微術(shù)針對較大的活生物樣品對光的吸收和散射特性，Huisken[7]等開發(fā)了選擇性平面照明顯微術(shù)(selectiveplaneilluminationm