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1、微流控芯片電泳在尿蛋白分離中的應(yīng)用論文褚少朋，王惠民，宋宏偉，叢輝，王躍國，張芹，張志泉，徐耀忠.freelplesplesorethan++inandglobulin.TheresultsericanHelenaagarosegelelectrophoresis.Results:Noproteinpeakplesofthecontrolgruop,butproteinpeaksplesofthecasegroupongthem16eresultasAmericanHelenaagarosegelelectrophoresisanditsacc
2、ordrateinclinicethodtoseparateproteinuriainmiddleandsmallhospitals.Keyicrofluidicchip;Electrophoresis;Urineproteins;Selectivityofproteinuria尿蛋白增多可來源于多種疾病，尿蛋白電泳有助于病因診斷及病情嚴(yán)重程度判斷。常用的尿蛋白電泳主要有醋酸纖維素薄膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。SDS-PAGE應(yīng)用最為普遍，可分離出不同分子量的蛋白質(zhì)，但該法操作極為繁瑣，花費(fèi)時間較長。
3、近年來國外把毛細(xì)管電泳(CE)1用于分離尿蛋白，雖操作簡便、快速，但需要昂貴的儀器，限制了臨床的廣泛推廣。近幾年發(fā)展起來的微流控芯片技術(shù)2具有高效、快速、試樣用量少、散熱能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。并可實(shí)現(xiàn)陣列并行操作,用于無機(jī)分子、有機(jī)分子、生物大分子(如DNA、氨基酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞)、細(xì)菌及病毒等的分析檢測已有較多研究報(bào)道，但鮮見在臨床上用于分離尿蛋白的報(bào)道，我們自行研制了微流控電泳芯片，并用于分離臨床尿蛋白的驗(yàn)證試驗(yàn)，效果很好，與美國Helena瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果100%相符，與臨床診斷符合率為97.14%。1材料與方法1.1對象(1)病例組：上海第二
4、軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院住院患者70例中,男40例，女30例,年齡24～89歲。其中尿毒癥14例，慢性腎炎21例，慢性腎衰4例，腎病綜合癥2例，多發(fā)傷2例，糖尿病等27例。留取尿蛋白定性在++以上的晨尿標(biāo)本70份。（2）對照組：健康人晨尿標(biāo)本30份，無腎臟病史及其他慢性病史，尿蛋白定性試驗(yàn)為陰性。1.2試劑與儀器（1）試劑：純?nèi)税椎鞍?、人運(yùn)鐵蛋白、人IgG購自美國Sigma公司，SP300plate瓊脂糖凝膠電泳試劑盒購自美國Helena公司。75mmol/L硼酸鹽(pH10.55)含0.8mmol/L乳酸鈣、1%(v/v)乙胺電泳緩沖液用雙蒸水配
5、制，使用前經(jīng)0.2μm濾膜過濾，并真空抽氣。（2）儀器：REP全自動電泳儀，美國Helena公司。自制微流控芯片：整個石英芯片尺寸為64mm×32mm，芯片微管道寬約70μm，深約40μm，芯片進(jìn)樣池到十字交叉點(diǎn)長4mm，有效分離長度為42mm，儲液池直徑為2.5mm。電泳儀與檢測系統(tǒng)為中科院微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所自制3,4，該系統(tǒng)可調(diào)輸出電壓為0～5000V，利用214nm紫外檢測器檢測蛋白濃度，軟件為自行設(shè)計(jì)。1.3方法1.3.1尿標(biāo)本預(yù)處理取尿樣5ml置分子量為7000透析袋中，于1L75mmol/LpH10.3硼酸鹽緩沖液中透析1小時，
6、于聚乙二醇20000中濃縮至干，用0.5ml雙蒸水洗出，磺基水楊酸-硫酸鈉比濁法測定蛋白質(zhì)含量。1.3.2電泳與檢測新制芯片分別用1mol/LNaOH、雙蒸水、電泳緩沖液浸泡30min。每次電泳前分別用1mol/LNaOH、雙蒸水、電泳緩沖液沖洗芯片管道1min并使電泳緩沖液充滿進(jìn)樣與分離管道，在樣品池加4μl待測尿蛋白樣品。進(jìn)樣時，進(jìn)樣管道兩端加500V電壓，分離管道兩端懸空，進(jìn)樣15s。分離時進(jìn)樣管道兩端懸空，分離管道兩端加1500V電壓，電泳4min。儀器在214nm自動記錄蛋白區(qū)帶信號，并對時間描出電泳圖譜。1.3.3Helena瓊脂糖
7、凝膠電泳從SP300plate瓊脂糖凝膠電泳試劑盒中取出膠片置于電泳槽上，點(diǎn)尿樣3μl，在21℃、350V條件下電泳8min，然后在60℃烘干11min。取出膠片置于染色槽內(nèi)染色、脫色、透明、自然涼干后在525nm掃描，儀器自動描出電泳圖譜。1.3.4判斷蛋白尿的選擇性分別計(jì)算白蛋白、球蛋白的峰面積，以白球蛋白的峰面積之比判斷蛋白尿的選擇性，如比值大于5，則為選擇性蛋白尿；反之則為非選擇性蛋白尿。2結(jié)果2.1微流控芯片電泳成份分辨力取4μl(純?nèi)税椎鞍住⑷诉\(yùn)鐵蛋白、人IgG各4g/L)3種標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合溶液放在微流控芯片中進(jìn)行檢測。如圖1所示，3
8、種標(biāo)準(zhǔn)蛋白獲得基線分離，人IgG首先出峰，人運(yùn)鐵蛋白其次，人白蛋白最后出峰。2.2微流控芯片電泳重復(fù)性將濃度均為5.0g/L的純?nèi)税椎鞍着c人運(yùn)鐵蛋白標(biāo)
