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1、蛋白質(zhì)提取的方法總匯中國(guó)生命科學(xué)論壇Ⅰ、植物組織蛋白質(zhì)提取方法（summer）1、根據(jù)樣品重量（1g樣品加入3.5ml提取液，可根據(jù)材料不同適當(dāng)加入），準(zhǔn)備提取液放在冰上。2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置（3-4小時(shí)）。3、用離心機(jī)離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃4、提取上清夜，樣品制備完成。蛋白質(zhì)提取液：300ml1、1Mtris-HCl（PH8）45ml2、甘油（Glycerol）75ml3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpoly
2、pyrrordone）6g這種方法針對(duì)SDS-PAGE，垂直板電泳?、颉⑷却姿帷恋矸?、在液氮中研磨葉片2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜，然后離心（4℃8000rpm以上1小時(shí)）棄上清。3、加入等體積的冰浴丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇），搖勻后離心（4℃8000rpm以上1小時(shí)），然后真空干燥沉淀，備用。4、上樣前加入裂解液，室溫放置30分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離心（15℃8000rpm以上1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間以沒有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)），可臨時(shí)保存在4℃待用。5、用Br
3、andford法定量蛋白，然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆?。藥品：提取液：?0%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。這種方法針對(duì)雙向電泳，雜質(zhì)少，離子濃度小的特點(diǎn)！當(dāng)然單向電泳也同樣適用，只是電泳的條帶會(huì)減少！6Ⅲ、組織：腸黏膜（newinbio）目的：WESTERNBLOT檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)應(yīng)用TRIPURE提取蛋白質(zhì)步驟：1.含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇：（1.5ml每1
4、mlTRIPURE用量）2.倒轉(zhuǎn)混勻，置室溫10min3.離心：12000g，10min，4度，棄上清4.加入0.3M鹽酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）5.振蕩，置室溫20min6.離心：7500g，5min，4度，棄上清7.重復(fù)0.3M鹽酸胍/95％乙醇步2次8.沉淀中加入100％乙醇2ml9.充分振蕩混勻，置室溫20min10.離心：7500g，5min，4度，棄上清吹干沉淀11.1％SDS溶解沉淀12.離心：10000g，10min，4度13.取上清-20度保存（或可直
5、接用于WESTERNBLOT）存在的問題：加入1％SDS后沉淀不溶解，還是很大的一塊，4度離心后又多了白色沉定，SDS結(jié)晶？測(cè)濃度，含量才1mg/ml左右。解決：提蛋白試劑盒，另外組織大小適中，要碎，立即加2XBUFFER，然后煮5－10分鐘，效果很好的。Ⅳ、lysissolution:（yog）Proteinextractionbuffer(Camiolobuffer):100ml=(0.075MPotassiumAcetate)0.736g(0.3M)NaCl1.753g(0.1M)L-arg
6、ininebasicsalt1.742g(0.01M)EDTA-HCl0.292g(0.25%)TritonX-100250.ulupto100mlwithdH20.pH7.4.Then0.2umfilter.1.Freezetissueinliquidnitrogen.2.RinseinPBSthenmince.63.Add1mlCamioloextractionbufferper100mgoftissue.4.Homogenizefor1minuteat4'C.5.Spinat3,000.rp
7、m/15minutes/4'C.6.Removesupernatantandsaveinanothertube.7.Ifnecessary,dializethesupernatantagainstPBSwith50mM/LTris-HClpH7.4.Ⅴ、植物材料：水稻苗，葉鞘，根（ynibcas）1、200毫克樣品置于冰上磨碎2、加lysisbuffer，離心，10000rpm，4度，5min取上清3、重復(fù)離心5minlysisbuffer：ureanp-40ampholine2-mepvp-40
8、Ⅵ、蛋白質(zhì)樣品制備（sigma）秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal等（1986）的方法進(jìn)行。100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巰基乙醇），混勻，-20℃沉淀1小時(shí)，4℃，15000r/min離心15min，棄上清，沉淀復(fù)溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巰基乙醇)，再于-20℃沉淀1小時(shí)，同上離心棄上清，（有必要再用80％丙酮(含10mMβ-巰基乙醇所得
