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1、海蜇酶解多肽制備及其抗腫瘤活性研究論文龍吟楊永芳甄茹陳鵬申林嚴(yán)容芳丁國(guó)芳【摘要】目的研究海蜇活性肽制備與抗腫瘤活性。方法海蜇先經(jīng)正交試驗(yàn)確定最佳酶解條件，然后將酶解物離心得到海蜇活性肽粗品。粗品經(jīng)超濾、SephadexG-15凝膠層析、冷凍干燥純化得到海蜇抗腫瘤活性肽，通過(guò)MTT法及AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞測(cè)定了其對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增值的影響。結(jié)果堿性蛋白酶在溫度為55℃，料液比為1:2，加酶量為1000U/g，時(shí)間為4h的酶解條件下對(duì)海蜇進(jìn)行酶解，酶解液中的氨基氮含量為41.3mg/100ml。從海蜇中分離純化得到活性肽，MTT法表明：其對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)抑制
2、作用.freeloractivitypeptidefromjellyfish(Rhopilemaesculentum).Methods:First,theorthogonalexperimentjellyfish.Then,crudeproductatographyandantitumoractivitypeptideethodanddouble-labeledfloetryAnnexinV-FITC/PIinedtheantitumoractivityofpeptide.ResultsUsingalkalineproteaseatatemperatureof55℃,eamounto
3、f1000U/g,hydrolysistimeejellyfish,andthehydrolyzateaminonitrogencontentedintheproductis41.3mg/100ml.Purifiedfromthejellyfishinavarietyofactivepeptides,MTTmethodshoorcellproliferationetryinducedapoptosisofthetumorcellsandapoptosisinadose-dependent.ConclusionThepeptidefromjellyfishhydrolysatecoul
4、dsignificantlyrestraintumorcellsmultiplicationandinducetumorcellsapoptosis.【Keyeanti-tumoractivityactivepeptides海蜇(Rhopilemaesculentum)俗稱“鮓魚”，隸屬于腔腸動(dòng)物門(Coelentera)、缽水母綱(Scyphozoa)、根口水母目(Rhizostomeae)、根口水母科(Rhizostomatidae)，海蜇屬(Rhopilema)的無(wú)緣膜動(dòng)物。海蜇的蛋白占其干重的50％，其氨基酸成分種類繁多，必須氨基酸含量豐富。海蜇等海洋生物為了適應(yīng)高鹽、高壓、
5、低溫、缺氧等極端的海洋生活環(huán)境，其蛋白質(zhì)的氨基酸組成與序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，在種類和數(shù)量上也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)陸地蛋白資源。在種類繁多的海洋生物蛋白氨基酸序列中，潛在著許多具有生物活性的氨基酸序列，用特異的蛋白酶水解，就能釋放出有活性的肽段?？鼓[瘤肽是一種具有抗腫瘤效果的生物活性肽（biologicallyactivepeptides,簡(jiǎn)稱BAPP）。目前已從海綿、海鞘、海兔、海藻、海苔蟲、鯊魚、珊瑚以及海洋微生物中分離出2萬(wàn)余種天然產(chǎn)物,其中不少化合物顯示出明顯的抗腫瘤活性,.freela3111型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司；酶標(biāo)儀
6、購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。2實(shí)驗(yàn)方法2.1蛋白酶及酶解條件的確定2.1.1水解酶選取將海蜇分別用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶在各自的酶解條件下對(duì)海蜇進(jìn)行酶解，酶解條件見表1。水解一定時(shí)間后，加熱至90～100℃滅酶15min，然后將水解液以6000r/min離心25min取上清液。測(cè)定氨基氮含量，選取最佳酶。表1酶的適宜作用條件2.1.2氨基氮含量測(cè)定氨基氮含量的測(cè)定采用甲醛滴定法5，取5.0ml酶解液，定容至100ml，取20ml酶解液稀釋液置于燒杯中，加水60ml，開動(dòng)磁力攪拌器，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液滴定至pH為8.2。加入10ml甲醛溶液混勻，再用0.05m
7、ol/L氫氧化鈉溶液繼續(xù)滴定至pH為9.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的毫升數(shù)，同時(shí)取水80ml做試劑空白試驗(yàn)。按下列公式計(jì)算氨基氮(ANN)含量：X：為樣品中氨基氮的含量（g/100ml）；V1：為測(cè)定用樣品加入甲醛稀釋后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液（ml）；V2：為試劑空白試驗(yàn)加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（ml）；V：為樣品液取用量（ml）；C：為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的濃度（mol/L）；0.014為氮的毫摩爾質(zhì)量（g/mmol）。2.1.3單酶水解條件的優(yōu)化以酶
