金黃色葡萄球菌檢測(cè)

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1、金黃色葡萄球菌檢測(cè)1設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：1.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。1.2冰箱：2℃～5℃。1.3恒溫水浴箱：37℃～65℃。1.4天平：感量0.1g。1.5均質(zhì)器。1.6振蕩器。1.7無菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸頭。1.8無菌錐形瓶：容量100ml、500ml。1.9無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。1.10注射器：0.5ml。1.11pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。2培養(yǎng)基和試劑2.1Baird-Park

2、er瓊脂平板：見附錄中1。2.2腦心浸出液肉湯(BHI)：見附錄中2。2.3兔血漿：見附錄中3。2.4營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面：見附錄中4。2.5無菌生理鹽水：見附錄中5。3操作步驟3.1樣品的稀釋3.1.1固體和半固體樣品稱取25g樣品置盛有225ml生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或置盛有225ml稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min，制成1：10的樣品勻液。3.1.2液體樣品以無菌吸管吸取25ml樣品置盛有225ml生理鹽水的無菌錐形

3、瓶(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1：10的樣品勻液。3.1.3用1ml無菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1ml，沿管壁緩慢注于盛有9ml稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1ml無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。3.1.4按3.1.3操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用一次1ml無菌吸管或吸頭。3.2樣品的接種根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行

4、10倍遞增稀釋時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1ml樣品勻液以0.3ml、0.3ml、0.4ml接種量分別加入三塊Baird-Parker平板，然后用無菌L棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25℃～50℃的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。3.3培養(yǎng)在通常情況下，涂布后，將平板靜置10min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱36℃±1℃培養(yǎng)1h；等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置于培養(yǎng)箱，36℃±1℃培養(yǎng)，45h～48h。3.4典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)3.4.1

5、金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2mm～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長(zhǎng)期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。3.4.2選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀釋度3個(gè)平板所有菌落數(shù)合計(jì)在20CFU～200CFU之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。如果：a）只有一個(gè)稀釋度平板的菌落數(shù)在20CFU～200

6、CFU之間且有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；b）最低稀釋度平板的菌落數(shù)小于20CFU且有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；c）某一稀釋度平板的菌落數(shù)大于200CFU且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；d）某一稀釋度平板的菌落數(shù)大于200CFU且有典型菌落，且下一稀釋度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落數(shù)不在20CFU～200CFU之間，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；以上按公式（1）計(jì)算。e）2個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在20CFU～200CFU之間

7、，按公式（2）計(jì)算。3.4.3鑒定從Baird-Parker平板中任選5個(gè)可疑菌落（小于5個(gè)全選），分別接種到5mlBHI和營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。取新鮮配置兔血漿0.5ml，放入小試管中，再加入BHI培養(yǎng)物0.2ml～0.3ml，振蕩搖勻，置36℃±1℃溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照。也可用商品化的試劑，按說明書操作，

8、進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。結(jié)果如可疑，挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mlBHI，36℃±1℃培養(yǎng)18h～48h，重復(fù)試驗(yàn)。4結(jié)果計(jì)算公式（1）：式中：T——樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)；A——某一稀釋度典型菌落的總數(shù)；B——某一稀釋度血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)；C——某一稀釋度用于血漿凝固酶試驗(yàn)的菌落數(shù)；d——稀釋因子。公式（2）：式中：T——樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)；A1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）典型菌落的總數(shù)；A2——