pcr引物設(shè)計(jì)技巧()

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1、PCR引物設(shè)計(jì)及軟件使用技巧←3’5’SenseprimerAntisenseprimer→王深浩引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗：a.非特異性擴(kuò)增b.擴(kuò)增產(chǎn)物量較少c.無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物2.引物設(shè)計(jì)的原則1.引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)2.引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)3.引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)引物設(shè)計(jì)時(shí)考慮的因素引物長(zhǎng)度堿基分布的均衡性Tm值引物二級(jí)結(jié)構(gòu)引物3’端引物5’端引物的內(nèi)部穩(wěn)定性引物的保守性與特異性常用的是18-27bp，太短則特異性降低容易引起錯(cuò)配，太長(zhǎng)則結(jié)合能量

2、過(guò)高，不易結(jié)合。1.引物長(zhǎng)度引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp2.引物GC含量在40%~60%間，上下游引物GC含量差異不要太大a.引物3’端的末位使用堿基A引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基3.引物的3’端b.引物3’端不要出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)相同堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加c.引物的延伸從3’端開(kāi)始，因此3’端的幾個(gè)堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對(duì)，不能進(jìn)行任何修飾，否則不能進(jìn)行有效的延伸，甚至導(dǎo)致PCR擴(kuò)增完全失敗。5.PCR反應(yīng)的Tm值（退火溫度）.一般在55～70℃之間。

3、（這個(gè)溫度不同軟件的計(jì)算差異很大，有時(shí)需要實(shí)驗(yàn)人員摸索條件）4.引物5’端引物5’端可以有與模板DNA不配對(duì)堿基，在5’端引入一段非模板依賴性序列，如增加酶切位點(diǎn)等6.引物中盡量避免發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體的出現(xiàn)。HairpinDimer7.防止引物錯(cuò)誤引發(fā)（Falsepriming）primer1primer1primer2primer2目的區(qū)域PrimerPremier5.0的特點(diǎn)人工操作，精度高對(duì)于復(fù)雜結(jié)構(gòu)引物設(shè)計(jì)可以結(jié)合試驗(yàn)條件對(duì)引物做出取舍總能設(shè)計(jì)出引物效率低，不適合大規(guī)模設(shè)計(jì)引物PrimerPremier3.0（online）的特點(diǎn)操作簡(jiǎn)單，方便

4、無(wú)需考慮太多的因素設(shè)計(jì)的引物可信度較高不能對(duì)于復(fù)雜結(jié)構(gòu)引物設(shè)計(jì)可以結(jié)合試驗(yàn)條件對(duì)引物做出取舍