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《聲波刺激對擬南芥基因表達(dá)的影響》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、2005年11月重慶大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)Nov.2005第28卷第11期JournalofChongqingUniversity(NɑturɑlScienceEdition)Vol.28No.11:1000-582X(2005)11-0138-043聲波刺激對擬南芥基因表達(dá)的影響王伯初,張 進(jìn),段傳人,王道紅(重慶大學(xué)生物工程學(xué)院生物力學(xué)與組織工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400030):運(yùn)用銀染mRNA逆轉(zhuǎn)錄差異顯示(DDRT-PCR)技術(shù),初步研究了聲波刺激對擬南芥差異基因表達(dá)的影響.研究分離得到SA3、SG2-1、SG2-2、SG7-1、SG7-2、CA2共6個差異表達(dá)基
2、因片段,進(jìn)一步運(yùn)用Northern點(diǎn)雜交確定SA3、CA2、SG7-1為陽性片段,其中SA3片段屬于聲波刺激特異表達(dá)基因,SG7-1片段屬于聲波刺激增強(qiáng)表達(dá)基因,CA2片段屬于聲波刺激抑制表達(dá)基因.研究結(jié)果表明植物在基因水平對聲波刺激具有響應(yīng),為下一步探索植物響應(yīng)聲波應(yīng)力的分子生物學(xué)調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ).:聲波刺激;擬南芥;差異顯示
:Q68:A[1] 由Liang等于1992年首次建立的mRNA差異組中加入1.26μgRNA樣品,然后加入錨定引物,錨顯示聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(mRNAdifferentialdisplay定引物和樣品的總體積達(dá)到11μL,不足11μL時加
3、PCR,DD-PCR)是目前在篩選、克隆差異表達(dá)基因方入DEPC處理水補(bǔ)足.于70℃育溫混合物5min,在冰上面廣為應(yīng)用的技術(shù).該方法通常采用測序膠放射自顯冷卻,加入:4μL,5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液;2μL,10mmol/L4×影來顯示擴(kuò)增條帶,雖然有敏感性高的優(yōu)點(diǎn),但是易造dNTP;20mmol/(min·L),RNase抑制劑;加DEPC水成放射性同位素污染,且實(shí)驗(yàn)周期長,對實(shí)驗(yàn)條件要求定容至19μL.在37℃育溫5min,加1μL,2.0×[2]52也較高.銀染方法的建立,始于1979年對蛋白質(zhì)的10mol/(min·L)的MMuLV逆轉(zhuǎn)錄酶,混合后在[3]染色,以后逐漸應(yīng)用于核酸.在筆者
4、的研究中,采用42℃育溫60min,加熱至70℃并維持10min停止反銀染mRNA差示顯示分析了聲波刺激后的擬南芥,并應(yīng),然后于冰上冷卻.獲得了3個陽性片段.1.2.3PCR在PCR擴(kuò)增中所選用的錨定引物和逆轉(zhuǎn)錄中的1 材料與方法錨定引物相同,隨機(jī)引物設(shè)計為:HAP1,AAGCTTGAT21.1材料TGCC;HAP2,AAGCTTCGACTGT;HAP3,AAGCTTT2將擬南芥分為聲波刺激組和對照組,聲波刺激的GGTCGA;HAP4,AAGCTTCTCAACG;HAP5,AAGCT2聲強(qiáng)為100dB,頻率為1000Hz.對刺激組刺激9d,每TAGTAGGC;HAP6,AAGCTTCGAC
5、CAT;HAP7,天刺激60min,實(shí)驗(yàn)組接受刺激時,對照組也拿出培養(yǎng)AAGCTTAACGAGG;HAP8,AAGCTTTTACCGC.箱,放置在與實(shí)驗(yàn)組條件一致的環(huán)境中.按照每個錨定引物和8個隨機(jī)引物配對,每個樣1.2方法品用3個錨定引物,則共有24個引物對.在PCR擴(kuò)增1.2.1總RNA的提取中所選用的錨定引物和逆轉(zhuǎn)錄中的錨定引物相同.采用RNeasyPlantMini試劑盒提取刺激組和對照1.2.4電泳組的總RNA.采用Bio-Rad的電泳槽和電泳儀,進(jìn)行6%變性1.2.2逆轉(zhuǎn)錄丙烯酰胺凝膠電泳.取3.5μLPCR產(chǎn)物與2μL甲酰在本次實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)文獻(xiàn)[4]合成3種錨定引物,胺上樣緩
6、沖液混合,置80℃孵育2min,將樣品加入oligo-d(T)10M(M=G,A,C).在每管刺激組和對照6%變性聚丙烯酰胺凝膠上,恒定電壓45V電泳約3:2005-07-08:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30470431) :王伯初(1962-),男,江蘇宜興人,重慶大學(xué)教授,博士,從事植物生物力學(xué)工程和生物制藥工程研究.第28卷第11期 王伯初,等:聲波刺激對擬南芥基因表達(dá)的影響1393.5～4h.加樣前先將凝膠加樣孔中的尿素用加樣器2.2銀染結(jié)果沖干凈,以利于得到高分辨率的差異顯示cDNA片段.電泳完畢后,用銀染法檢測不同材料基因轉(zhuǎn)錄水1.2.5
7、銀染平上的差異,根據(jù)差異片段的大小和重復(fù)性結(jié)果筆者[5][6]參考Carlos和Brant的方法對硝酸銀染色方選取了6條條帶,結(jié)果見圖2.片段SA3的大小為法進(jìn)行改進(jìn).銀染步驟:1)固定,加入100mL固定溶270bp,片段CA2的大小為370bp,片段SG2-1的大液(10%乙醇,1%醋酸),輕輕搖動10min.2)漂洗,用小為300bp,片段SG2-2的大小為190bp,片段蒸餾水洗膠1min.3)預(yù)處理,用100m
