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1、3-磷酸脫氫酶基因克隆與序列分析食用菌@2011.18(2):5～9文章編號:1005—9873(2011)02—0005—05斑玉蕈甘油醛一3一磷酸脫氫酶基因克隆與序列分析張津京.,陳輝,馮志勇,陳明杰,汪虹(農業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室,國家食用菌工程技術研究中心,上海市農業(yè)遺傳育種重點開放實驗室,上海市農業(yè)科學院食用菌研究所,上海201403;南京農業(yè)大學生命科學學院,南京210095)摘要:甘油醛一3一磷酸脫氫酶(glyceraldehyde.3一phosphatedehydrogenase,GAPDH)是糖酵解和卡爾文循環(huán)中的關鍵酶,本實驗室之前的研究發(fā)現斑玉
2、蕈菌絲的GAPDH表達隨培養(yǎng)基中葡萄糖添加濃度的變化而變化,在此基礎上我們首次克隆了斑玉蕈GAPDH的DNA和cDNA序列,結果斑玉蕈基因長2724bp,對比基因組DNA和cDNA序列知其中有7個內含子,8個外顯子;其理論分子量為36.15kD,編碼蛋白質含338個氨基酸,等電點(PI)為8.24.關鍵詞:斑玉蕈;甘油醛一3.磷酸脫氫酶;基因克隆;序列分析甘油醛.3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde一3一phosphatedehydrogenase,GAPDH)是糖酵解途徑和葡萄糖異生作用過程中的一個關鍵酶基因,有較強的轉錄調控能力[1].同時GAPDH也是一種很重要
3、的抗逆境脅迫基因.HARRIS和WATERS[2]研究表明GAPDH可以大致分為煙酰胺結合區(qū),催化區(qū)和S.1oop區(qū).同時,0LSEN研究也表明甘油醛.3.磷酸脫氫酶的S.1oop區(qū)已經被證實非常重要,因為它包含一個疏水序列,是形成四聚體酶和重要離子與底物結合的核心.這個位點被證明在決定其熱穩(wěn)定性上也是至關重要的_4].還有研究表明在S.1oop區(qū)中有24個氨基酸(178.201aa),第183,185和195位的氨基酸影響著C.149和康寧木霉酸結合的活性,因此決定了GAPDH對抑制劑的敏感性[5-7_.斑玉蕈(HypsizysusmM口")又名玉蕈,真姬菇,蟹味菇等,是一
4、種珍稀食用菌,它隸屬擔子菌亞門,層菌綱,傘菌目,白蘑科,玉蕈屬,自然分布于歐洲,北美,西伯利亞和日本等地_8].本實驗室先前對斑玉蕈表達譜的研究表明,在不同葡萄糖濃度培養(yǎng)條件下該菌的菌絲和原基中甘油醛.3.磷酸脫氫酶表達量差異很大.目前斑玉蕈GAPDH基因尚無報道,為了深入研究GAPDH在斑玉蕈子實體發(fā)育過程中的作用,筆者分別克隆得到斑玉蕈GAPDH的DNA和cDNA序列,并利用生物信息學方法對其編碼區(qū)產物進行了預測和分析.1材料和方法1.1菌株和質粒斑玉蕈(H.marmoreus)菌株SIEF3133是由上海市農業(yè)科學院食用菌研究所保藏中心保藏;感受態(tài)細胞購自Tiangen
5、公司,質粒載體pGEM.Teasy購自TaKaRa公司.1.2試劑PCR試劑購自Takara公司,凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術有限公司,反轉錄PCR(RT.PCR)試劑盒購自TaKaRa公司,Redzol購自北京賽百盛基因技術有限公司,DEPC水購自BioBasicInc公司.1.3菌絲培養(yǎng)及DNA和RNA提取及cDNA的合成斑玉蕈菌絲在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)大概15d長滿平板后,將菌絲刮取于一70℃冷凍過夜,按參考文獻E93的方法提取基因組DNA;總RNA收稿日期:2011—02—27原稿;2011—04—12修改稿基金項目:國家科技支撐計劃項目(編號:2010BAK69B
6、18),上?？莆蒲衅脚_建設專項(編號:09dz2200800),上海市科委崇明科技攻關專項(編號:10DZ1960100)的部分研究內容作者簡介:張津京(1985一),女,2009級南京農業(yè)大學生命科學學院碩士研究生,主要從事食用菌的遺傳與栽培的研究.本文通訊作者E-mail:fincbio@yahoo.com.cn食用菌第18卷提取采用Trizol法[1.單鏈cDNA的合成根據Takara反轉錄試劑盒說明書進行.1.4斑玉蕈gpd基因全長及cDNA序列的獲得根據雙色蠟蘑(Laccariabicolor,XM001887335),裂褶菌(Schizophyllumcommu
7、ne,XM003028287),香菇(Lentinulaedodes,AB012862)和金針菇(Flammulinavelutipes,AF515622)的gpd基因核苷酸序列進行同源性比對,選取高保守序列設計兼并引物進行巢式PCR.兼并引物序列分別為:gpdF1.GTTCAAGTAYGAYTCCGTCCA:gpdR1.TARCCCCACTCRTTGTCGTAC:gpdF2-CGAGTCHACBGGTGTYTTYAC:gpdR2-GGARACRASRBBGTCCTCDGT.PCR反應參數是:94℃預變
