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1、細胞凋亡檢測方法一、細胞凋亡的形態(tài)學檢測1?光學顯微鏡和倒置顯微鏡（1）?未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，全面皺縮，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體，凋亡小體為數(shù)個圓形小體圍繞在細胞周圍。貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。 ?。?）?染色細胞：姬姆薩（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常細胞核色澤均一；凋亡細胞染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)；壞死細胞染色淺或沒染上顏色。蘇木素-伊紅（HE）染色：細胞核固縮碎裂、呈藍黑色、胞漿呈淡紅色（
2、凋亡細胞），正常細胞核呈均勻淡藍色或藍色，壞死細胞核呈很淡的藍色或藍色消失。2?熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡 一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變?yōu)橹笜藖碓u判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：Hoechst?33342，Hoechst?33258，DAPI。三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，能進入正常細胞膜而對細胞沒有太大細胞毒作用。Hoechst33342在凋亡細胞中的熒光
3、強度要比正常細胞中要高。DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。PI和Hoechst33342雙標：PI、Hoechst33342均可與細胞核DNA（或RNA）結(jié)合。但PI不能通過正常細胞膜，Hoechst則為膜通透性熒光染料，故細胞在處于壞死或晚期調(diào)亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。正常細胞和中早期調(diào)亡細胞均可被Hoechst著色，但是正常細胞核的Hoechst著色的形態(tài)呈圓形，淡蘭色，內(nèi)有較深的蘭色顆粒；而調(diào)亡細胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。故PI著色為壞死細胞
4、；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調(diào)亡細胞。凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體(圖1)。63?透射電子顯微鏡觀察 凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis?nuclei）的細胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）
5、的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)；Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細胞膜內(nèi)側(cè)，但在細胞凋亡早期，PS可從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜表面，暴露在細胞外環(huán)境中。磷脂酰絲氨酸的轉(zhuǎn)位發(fā)生在凋亡早期階段，先于細胞核的改變、DNA斷裂、細胞膜起泡。體內(nèi)的吞噬細胞可通過識別磷脂酰絲氨酸來清除凋亡細胞。Annexin-V（green）是一種分子量為35~36KD的C
6、a2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合，細胞處于調(diào)亡或壞死時，Annexin-V可為陽性（早期壞死細胞可能為陰性），是檢測細胞早期凋亡的靈敏指標。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。PI和Annexin-V雙標：碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。
7、因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。*注意：細胞凋亡時其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞標志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時應該注意?；罴毎荒鼙籄nnexinV-FITC或PI染色（右圖左下象限）。早期凋亡細胞因磷脂酰絲氨酸的暴露及具有完整細胞膜，故呈AnnexinV-FITC染色陽性及PI染色陰性（右圖右下象限）。壞死或晚期凋亡的細胞呈Annexi
8、nV-FITC及PI染色雙陽性（右圖右上象限）。*注意：未處理的對照細胞進行常規(guī)培養(yǎng)的過程中也有一小部分的細胞死亡發(fā)生。三、線粒體膜電位的檢測線粒體跨膜電位下降，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負性的增高或降低。名稱檢測原理3，3’-Dihexyloxacarbocyanineio
