植物提取物的分離純化技術(shù)

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1、蒼山大蒜低聚糖純化技術(shù)研究及分子質(zhì)量測(cè)定摘要：本論文旨在建立蒼山大蒜中低聚糖（GOS，Garlicoligosaccharide）的分離純化技術(shù)，并測(cè)定其分子質(zhì)量。分別研究了聚酰胺色譜法、離子交換色譜法、有機(jī)溶劑沉淀法和葡聚糖凝膠色譜法對(duì)GOS的純化效果。結(jié)果表明，聚酰胺色譜柱對(duì)大蒜粗糖中蛋白質(zhì)的脫除率為66.8%，糖回收率為98.9%；經(jīng)DEAE-纖維素（OH-）色譜柱、乙醇分級(jí)沉淀和SephadexG-25色譜柱純化后，GOS的純度為99.1%，數(shù)均分子質(zhì)量為1770D，。關(guān)鍵詞：大蒜；低聚糖；分離純化大蒜營(yíng)養(yǎng)豐富，在我國(guó)歷來(lái)被視為藥食兩用的佳品。據(jù)報(bào)道，大蒜

2、有降血脂、抗菌消炎、抗腫瘤、保護(hù)肝臟和抗衰老等作用[1-3]。其中，大蒜中的糖類物質(zhì)是蒜中的主要活性成分之一[4-8]。大蒜低聚糖屬雜果聚糖[8-10]，具有益生元的作用[11]。低聚果糖有雙向調(diào)節(jié)人體腸道微生態(tài)的功能，且低聚果糖很難被人體消化吸收，是一種低能量的糖，不會(huì)引起肥胖。低聚果糖作為一種水溶性膳食纖維，能降低血清膽固醇和甘油三酯含量，所以低聚果糖也可作為高血壓、糖尿病和肥胖癥等患者使用的甜味劑[12]。由于大蒜產(chǎn)地和品種等不同，對(duì)經(jīng)分離純化得到的大蒜多糖性質(zhì)的研究報(bào)道并不一致。蒼山大蒜的外形較差，不宜作為商品直接出售。但蒼山大蒜富含低聚糖，具有較高的開(kāi)發(fā)

3、利用價(jià)值。本文旨在建立蒼山大蒜低聚糖的分離純化技術(shù)，并測(cè)定其分子質(zhì)量，為大蒜低聚糖的進(jìn)一步研究及應(yīng)用提供基本方法。1．材料與方法1.1材料與試劑大蒜蒼山大蒜；聚酰胺（30-60目）國(guó)藥集團(tuán)上海試劑公司；DE-52Whatman公司；SephadexG-25、藍(lán)色葡聚糖-2000Pharmacia公司；果糖標(biāo)準(zhǔn)品Amresco公司；多糖標(biāo)準(zhǔn)品Fluka公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2儀器與設(shè)備TDZ5-WS型離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；IGJ0.5冷凍干燥機(jī)北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海菁華科技儀器有限公司；BS-100A自動(dòng)部分收集器

4、上海滬西分析儀器廠有限公司；高效液相色譜系統(tǒng)日本島津公司；高效液相色譜柱奧秘BauloSB5-2546-c18-060C18柱（4.6mm×250mm，5μm）。1.3技術(shù)路線鮮蒜→高溫滅酶→破碎→提取→沉淀→凍干→純化1.4方法大蒜粗糖提取采用本實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法[13]。1.4.1蛋白質(zhì)脫除效果的比較研究Sevag法對(duì)蛋白質(zhì)的脫除效果研究：稱取10.0g粗糖干粉溶于100mL蒸餾水中，配成粗糖溶液，加入20mL的Sevag試劑（氯仿：正丁醇=5：1，V/V），劇烈振搖20min，靜置30min，3000r/min離心15min，收集上清液，重復(fù)操作數(shù)次，至無(wú)

5、變性蛋白質(zhì)出現(xiàn)為止?？捡R斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[14]，苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量[15]，計(jì)算糖損失率和蛋白質(zhì)脫除率。聚酰胺柱色譜法對(duì)蛋白質(zhì)的脫除效果研究：取一定量的大蒜粗糖上樣（φ2.5cm×34cm），蒸餾水洗脫，分別采用苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定洗脫液中的總糖和蛋白質(zhì)含量。計(jì)算糖損失率和蛋白質(zhì)脫除率。量取7mL聚酰胺裝柱（φ1cm×20cm），2g粗糖上樣，蒸餾水洗脫，至無(wú)糖洗出為止。測(cè)定洗脫液中蛋白含量，計(jì)算動(dòng)態(tài)吸附容量。1.4.2大蒜低聚糖的DEAE-纖維素色譜柱法純化經(jīng)脫蛋白后的大蒜低聚糖1.5mL上樣（f8mm×170mm），

6、上樣濃度為5%（g/mL），梯度洗脫，流動(dòng)相分別為：蒸餾水，0.05mol/LNaCl，0.10mol/LNaCl，0.15mol/LNaCl，0.20mol/LNaCl，0.25mol/LNaCl，0.20mol/LNaOH。自動(dòng)部分收集器收集洗脫液（3min/管），共收集98管，苯酚-硫酸法測(cè)每管總糖含量，繪制洗脫曲線。收集主要組分，采用HPLC測(cè)定其分子質(zhì)量分布。色譜條件為：GPC色譜柱：SB-802.5；流動(dòng)相：三蒸水；流速：0.8mL/min；柱溫：30℃；柱壓：3.0MPa；示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。1.4.3大蒜低聚糖的沉淀法分級(jí)純化稱取2.0g經(jīng)DEAE

7、-纖維素色譜柱純化得到的中性糖，溶于10mL蒸餾水。加10mL95%（V/V）乙醇，4℃靜置2h，3500r/min離心15min，收集沉淀（記作沉淀1），上清液繼續(xù)加10mL95%（V/V）乙醇，收集沉淀2，重復(fù)上述步驟8次，最后一次醇沉后，上清液水浴揮干，收集干物質(zhì)。HPLC測(cè)定不同沉淀組分的分子質(zhì)量分布（方法同1.4.2）。1.4.4大蒜低聚糖的葡聚糖凝膠SephadexG-25色譜柱法純化取分級(jí)沉淀5至8的合并樣品10mg溶解上樣（f12mm′300mm），蒸餾水洗脫，流速5d/min，自動(dòng)部分收集器收集（7min/管），測(cè)定洗脫液中總糖含量，繪制洗脫曲線

8、，收集主峰