煙草淀粉酶活性與多酚氧化酶活性測定實驗方案

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1、煙草中淀粉酶活性與多酚氧化酶活性的測定淀粉酶活性的測定原理：根據(jù)淀粉酶水解淀粉產(chǎn)生的一系列還原性糖類可將3，5-二硝基水楊酸還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，通過溶液顏色的深淺可反映出還原性糖類的濃度，也就可以間接反映出淀粉酶的活性，因此，可以用比色法，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測定淀粉酶的活性。實驗材料，儀器，試劑（1）.材料：煙草新鮮葉片組織（2）.儀器：a.分光光度計b.離心機c.恒溫水浴鍋d.具塞刻度管e.容量瓶（3）.試劑：a.標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液（1mg/ml）；精確稱取100mg麥芽糖，用蒸餾水溶解，定容至100ml。b.3，5-二硝基水楊酸（10mg/ml）；精確稱取1

2、g3，5-二硝基水楊酸，溶于20ml12mol/L的HONa溶液中，加入50ml蒸餾水，再加30g酒石酸鉀鈉，待其溶解后用蒸餾水定容至100ml。c.1﹪氯化鈉溶液，稱取5g氯化鈉于500ml容量瓶中定容。d．1﹪淀粉溶液；稱取1g淀粉溶于100ml0.1ml/L的檸檬酸鈉溶液中。實驗步驟（1）.儀器藥品的準(zhǔn)備與配置；按實驗需求，將所有實驗中用到的器材（大型實驗設(shè)備應(yīng)進行檢查，做好使用前準(zhǔn)備工作）試劑準(zhǔn)備好a.器材包括稱量用到的分析天平以及電子天平，溶解用到的容量瓶（100ml×；1000ml×2），燒杯(包括100ml×5和500ml×1)，玻璃棒，量筒等，以及實驗用的

3、數(shù)支具塞刻度試管，將上述儀器洗凈并用蒸餾水浣洗，同時檢查分光光度計，離心機，恒溫水浴鍋等設(shè)備b．按照要求將所需求的試劑按步驟配制好，貼好標(biāo)簽，待用c．冷凍樣品提前做好解凍工作（2）．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作；取10支具塞刻度試管，分別編號，以1號為空白對照分別按下表加入相應(yīng)試劑編號試劑123456789標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液（ml）02468101214163,5-二硝基水楊酸溶液（ml）222222222定容至20m1l00℃水浴鍋反應(yīng)5min之后取出用流水冷卻，以1號試管為空白調(diào)零點，在540nm波長下比色測定2～10號試管的OD540值，以麥芽糖含量（濃度）為橫坐標(biāo)，各濃度下的OD值

4、為縱坐標(biāo)，用坐標(biāo)紙繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程。（3）．酶溶液的提?。粚悠贩謩e編號，按以下步驟分別操作a．稱取2g樣品于研缽中，加入少許石英砂和2ml氯化鈉溶液，研磨成勻漿；b.將勻漿轉(zhuǎn)入離心管中，并用6ml氯化鈉溶液分次洗滌研缽，將殘渣一并洗入離心管內(nèi)，于室溫下放置15～20min，沒隔數(shù)分鐘攪動一次，使其充分提取c．然后待全部樣品按上述步驟完成后，一次性轉(zhuǎn)入離心機內(nèi)，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，將上清液到入100ml容量瓶中，定容，搖勻，貼上相對應(yīng)于樣品的編號，即為淀粉酶原液，依據(jù)實際情況做好保存工作，防止酶活性退化或酶失活（4）．樣品淀粉酶活力的測定；

5、對于每個樣品進行一下操作取兩支具塞刻度試管，編號為1和2，按下表加入以下試劑試管編號試劑12樣品酶原液（ml）20100℃水浴鍋中煮10min樣品酶原液（ml）021﹪淀粉溶液（ml）2237℃水浴鍋中反應(yīng)10min3，5-二硝基水楊酸溶液（ml）22100℃水浴鍋反應(yīng)5min用蒸餾水定容至20ml，適當(dāng)稀釋后于540nm波長下測定OD值，以1號試管為空白調(diào)零分別對每個樣品按上述（4）步驟進行檢測，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)并計算結(jié)果，將數(shù)據(jù)匯總后做成表格，其中樣品淀粉酶活力=△C×VT/(W×Vs×T)(mg/g/min)。式中，△C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的麥芽糖含量（mg）；VT為淀粉

6、酶原液總體積（ml）；Vs為反應(yīng)所用淀粉酶原液體積（ml）；W為樣品重量（g）；t為反應(yīng)時間（min）。對實驗結(jié)果做出相應(yīng)的分析和評價。樣品編號OD值A(chǔ)=520.00nm還原糖含量(mg/ml)酶活力(mg/g/min)WB-080.1420.7422.373WB-110.1700.9192.941WB-150.1460.7672.454WB-190.2431.3814.420WB-120.1440.7542.414WB-180.2141.1983.832WB-090.1190.5961.907WB-13(1)0.2801.6165.170WB-160.1550.8242

7、.637WB-170.1470.7732.474WB-13(2)0.2021.1223.589WB-200.2571.4704.704WB-210.2921.6925.413WB-100.1540.8182.616煙草中多酚氧化酶活性的測定原理：多酚氧化酶在有氧條件下會將酚氧化為醌，醌在525nm波長下有較強的吸光值，通過測定525mn下的吸光值變化可測得多酚氧化酶材料，儀器，試劑（1）材料：煙草葉片組織（2）儀器：分光光度計離心機勻漿機試管吸量管（3）試劑：a.0.05mol/LPH=5.5的磷酸緩沖溶液b.0.1mol/L