小反芻獸疫免疫膠體金試紙卡檢測方法

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1、ICS點(diǎn)擊此處添加ICS號點(diǎn)擊此處添加中國標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類號SN中華人民共和國出入境檢驗檢行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)XX/TXXXXX—XXXX小反芻獸疫免疫膠體金試紙卡檢測方法Colloidalgoldimmunochromatographicassayfordetectionofpestedespetitsruminants點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布XX/TXXXXX—XXXX前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)附錄A、B為規(guī)范性附錄，附錄C、D為資料性

2、附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國西藏出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國深圳出入境檢驗檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：楊俊興、劉忠清、赤列加措、文藝、孫潔、劉建利、唐金明、花群義。本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。8XX/TXXXXX—XXXX小反芻獸疫免疫膠體金試紙卡檢測方法1　范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了進(jìn)出口動物小反芻獸疫免疫膠體金試紙卡檢測方法的檢疫技術(shù)規(guī)范。包括樣品的采集和處理、免疫膠體金試紙卡的組裝、樣品檢測、結(jié)果判定等方法和技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于進(jìn)出口動物小反芻獸疫血清抗體快速檢測和現(xiàn)場檢疫。2　規(guī)范性引用文件下列文

3、件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18088出入境動物檢疫采樣GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法SN/T2123-2008出入境動物檢疫實驗樣品采集、運(yùn)輸和保存規(guī)范3　縮略語3.1BSA：牛血清白蛋白3.2ICS:免疫層析試紙3.3PBS：磷酸緩沖液3.4PPR：小反芻獸疫3.5PPRV：小反芻獸疫病毒3.6SPG：鏈球菌G蛋白4　主要試劑和材料除特別說明外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純。試驗用水為符合GB/T6682規(guī)定的三級水

4、。4.11%氯金酸溶液（AuCl3·HCl·3H2O）。4.21%檸檬酸鈉溶液。4.3PPRVN蛋白：為基因工程表達(dá)蛋白抗原（氨基酸序列見附錄D）。4.4鏈球菌G蛋白(SPG）。8XX/TXXXXX—XXXX4.51%碳酸鉀溶液（K2CO3）。4.6抗SPG多克隆抗體。4.7牛血清白蛋白（FragmentV）。4.8硝酸纖維素膜。4.9玻璃纖維棉紙。4.10PPRV陽性血清。4.11PPRV陰性血清。1　主要設(shè)備5.1恒溫箱：37℃±1℃。5.2電子天平：精確值0.0001g。5.3臺式冷凍離心機(jī)：最大離心力15000×g。5.4PH計。5.5試紙噴膜儀。5.

5、6試紙條切割機(jī)：可連續(xù)切割出2~5mm寬試紙。2　檢測原理將膠體金標(biāo)記的SPG體固定于金標(biāo)墊，檢測線為純化的PPRVN蛋白，對照線為兔抗SPG。檢測時，陽性樣品中的抗PPRV抗體與膠體金標(biāo)記SPG特異性地結(jié)合，在NC膜上移動時，被檢測線上的PPRVN蛋白捕獲，膠體金顆粒聚集于此，形成紅色的條帶，即檢測線。相反，陰性樣品中不含抗PPRV抗體，在檢測線處不形成紅色條帶。對照線試劑兔抗SPG與膠體金標(biāo)記SPG結(jié)合，捕獲金標(biāo)復(fù)合物，形成對照線。3　免疫膠體金試紙卡的組裝7.1金標(biāo)SPG及金標(biāo)墊的制備首先用1%碳酸鈉溶液調(diào)膠體金溶液的pH值為6.5，向50mL膠體金溶液

6、中緩慢地加入適量SPG溶液，室溫攪拌30min，緩慢加入10%BSA至其終濃度為1%（w/v），繼續(xù)攪拌30min。4℃4,000×g離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，4℃12,000×g離心30min，小心棄去上清。用5mL（即1/10原體積）PBS（pH7.0）重懸沉淀。加入1%（w/v）的疊氮鈉（NaN38XX/TXXXXX—XXXX）溶液至終濃度為0.02%，用試紙噴膜儀將膠體金溶液噴于300×5mm玻璃纖維棉上，速度為50μL/cm，并于4℃真空抽干，于4℃干燥保存?zhèn)溆谩?.2檢測線和對照線的制備用純化的濃度為2mg/mL的PPRVN蛋白和兔

7、抗SPGIgG分別作為檢測線和對照線試劑。用試紙噴膜儀將兩種試劑分別點(diǎn)在硝酸纖維膜上，點(diǎn)樣速度為0.75μL/cm。37℃干燥2h，4℃密封保存?zhèn)洹?.3試紙卡的組裝按附錄B圖1所示，將背襯、樣品墊、吸水墊、硝酸纖維膜、金標(biāo)墊粘在一起，并試紙條切割機(jī)將其切成3.5mm寬的試紙條，將試紙條放入試紙卡中。4℃干燥保存?zhèn)溆谩?　樣品采集、處理和保存采集動物全血樣品后，室溫靜置約30min，使血液自然凝固。5000×g離心10min，收集上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，于56℃水浴中作用30min后，待血清樣品恢復(fù)室溫后用于檢測。血清樣品也可放4℃暫時保存或-80℃保存?zhèn)溆?/p>

8、。2　樣品檢測9.1從2~8℃冰箱中取