實驗三十四 植物葉綠體色素的提取、分離、表征及含量測定

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1、摘自王尊本主編，綜合化學實驗（第二版），第226-244頁，北京：科學出版社，2007年9月。實驗三十四植物葉綠體色素的提取、分離、表征及含量測定[1-27]一、葉綠體色素的提?。ㄒ唬嶒災康?）掌握有機溶劑提取葉綠體色素等天然化合物的原理和實驗方法。2）了解皂化-萃取提取b-胡蘿卜素的原理。3）了解1,4-二氧六環(huán)沉淀法提取葉綠素的原理。（二）實驗原理植物光合作用是自然界最重要的現(xiàn)象，它是人類所利用能量的主要來源。在把光能轉化為化學能的光合作用過程中，葉綠體色素起著重要的作用。高等植物體內的葉綠體色素有葉綠素和類胡蘿卜素兩類，主要包括葉綠素a、葉綠

2、素b、b-胡蘿卜素和葉黃素四種。它們所呈現(xiàn)的顏色和在葉綠體中含量大約比例見表34.1。表34.1高等植物體內葉綠體色素的種類、顏色及含量項目葉綠素類胡蘿卜素葉綠素a葉綠素bb-胡蘿卜素葉黃素顏色藍綠色黃綠色橙黃色黃色在葉綠體內各色素含量比例312131葉綠素(chlorophylls)是葉綠酸的酯，它在植物進行光合作用中吸收可見光，并將光能轉變?yōu)榛瘜W能。葉綠素是植物進行光合作用所必需的催化劑。在綠色植物中葉綠素主要以葉綠素a（C55H72O5N4Mg）和葉綠素b（C55H70O6N4Mg）兩種結構相似的形式存在，其差別僅是葉綠素a中一個甲基被葉綠素b

3、中的甲酰基所取代。葉綠素的基本結構見圖34.1。在葉綠素分子結構中含有四個吡咯環(huán)，它們由四個甲烯基聯(lián)結成卟啉環(huán)，在卟啉環(huán)中央有一個鎂原子，它以兩個共價鍵和兩個配位鍵與4個吡咯環(huán)的氮原子結合成內配鹽，形成鎂卟啉。在葉綠素分子中還有兩個羧基，其中一個與甲醇酯化成COOCH3，另一個與葉綠醇酯化成COOC20H39長鏈。類胡蘿卜素(carotenoids)是一類不飽和的四萜類碳氫化合物（例如胡蘿卜素，carotenes)，或它們的氧化衍生物（例如葉黃素類，xanthophylls)。所有的類胡蘿卜素均源于非環(huán)狀的C40H56結構。類胡蘿卜素在強光下可防止葉

4、綠素的光氧化；在弱光下，可作為輔助色素吸收光能并傳遞給葉綠素分子。胡蘿卜素有3種異構體，即a-、b-和g-胡蘿卜素，其中b-胡蘿卜素含量最多，也最為重要。b-胡蘿卜素還具有維生素A的生理活性，其結構是由兩分子維生素A在端鏈失去兩分子水結合而成。在生物體內，b-胡蘿卜素受酶催化氧化即形成維生素A。而葉黃素(3，3`-二羥基-α-胡蘿卜素，lutein，C40H56O2)是一種常見的氧化型的類胡蘿卜素。植物葉綠體色素的提取、分離、表征及含量測定在植物生理學、農業(yè)和海洋科學研究中具有重要意義。同時，葉綠素和胡蘿卜素等天然色素在食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)中也有廣泛的

5、用途。圖34.1葉綠素a、葉綠素b、b-胡蘿卜素、葉黃素和維生素A的結構式葉綠素a和b都是吡咯衍生物與金屬鎂離子的配合物，盡管它們分子中含有一些極性基團，但大的烷基結構使它們易溶于丙酮、乙醇、乙醚和石油醚等有機溶劑中。而b-胡蘿卜素和葉黃素是典型的四萜化合物。與胡蘿卜素相比，葉黃素易溶于醇而在石油醚中的溶解度較小。由于葉綠體色素在植物細胞內并非以游離態(tài)存在，而是與蛋白質等結合存在于葉片中，在提取時應先將植物細胞擊破，釋放出葉綠體色素，然后再根據色素的溶解特性，采用丙酮、乙醇、乙醚、丙酮-乙醚和甲醇-石油醚等有機溶劑提取。由于粗提取液中還可能包括殘余植

6、物組織和其它可溶性雜質，實驗中應對粗提液進一步純化。（三）實驗儀器與試劑1.儀器研缽，量筒，分液漏斗等常用玻璃儀器一套，離心機一臺。2.試劑丙酮，乙醇，乙醚，石油醚等有機溶劑。飽和氯化鈉水溶液。碳酸鎂和無水硫酸鈉。（四）實驗步驟1．葉綠體色素的提取方法一：新鮮綠葉蔬菜，如菠菜、空心菜等，洗凈后棄除葉柄和中脈，然后用吸水紙將菜葉表面的水分吸干。稱取處理過的菜葉5g，剪碎后放在干凈的研缽內，加入0.1g碳酸鎂，先將菜葉粗搗爛，然后加入10mL乙醇-石油醚（2:3），迅速研磨5min。用一不銹鋼網濾去菜葉殘渣，再研磨提取一次。最后再用10mL乙醇-石油醚（

7、2:3）洗滌研缽等容器，一并過濾。方法二：類似于方法一，采用丙酮提取，但在純化時應事先在分液漏斗中加入15mL石油醚。2．粗提取液的純化純化色素時，將合并的濾液轉入分液漏斗，加入5mL飽和的NaCl溶液和45mL蒸餾水，輕輕振蕩，放置分層。小心地把下層的含乙醇或丙酮水溶液放掉，余下的色素提取液進一步采用離心分離。取上層有機相，加入少量無水Na2SO4除去殘余水分。若提取液色素濃度太低，可用旋轉蒸發(fā)（控制30～35℃水浴）或冷吹風方式進行適當濃縮（約10mL），轉入具塞的棕色瓶中置于暗處保存。3.皂化-萃取法提取b-胡蘿卜素將20mL植物色素甲醇-石油

8、醚提取溶液移入100mL分液漏斗中，加入5mL30%KOH甲醇溶液（將KOH加到90%甲醇水溶液中配制），充